稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶_PEPCase_基因的克隆与分析
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是一种重要的酶类，参与碳的代谢过程，在许多生物体中起着关键的作用。
该酶催化磷酸烯醇化合物和二氧化碳在碳代谢途径中的转化，将磷酸烯醇化合物转化为草酰乙酸（oxaloacetate）。
本文将对磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构、功能和调节机制进行探讨。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶是一种转运酶（transcarboxylase），催化的反应是将磷酸烯醇化合物和碳酸转化为草酰乙酸。
该酶广泛存在于植物、细菌和真核生物的细胞质中，并且在植物中存在多个亚型。
PEPC在植物中起着重要的作用，特别是在光合作用的碳固定和二氧化碳浓缩中。
在一些C4植物（如玉米、甘蔗和高粱）中，PEPC被发现在叶肉细胞的细胞质中大量表达，它们参与光合作用的初始碳固定步骤。
因此，PEPC在植物的生长和发育中起着重要的调控作用。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的结构是多样的，不同来源的酶具有不同的亚型和结构特征。
然而，这些结构中的酶都具有共同的特点，包括高度保守的活性位点和催化中心。
PEPC通常是由四个相同的亚基组成，每个亚基包含一个催化中心。
这些亚基通过非共价相互作用力（如离子键、氢键和疏水相互作用）相互结合形成四聚体结构。
在催化中心中，PEPC通过与金属离子（如锰、镁或钙）结合来促进催化反应。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的功能主要体现在其对碳代谢途径的调控。
PEPC在光合作用过程中起到关键的作用。
在C4植物中，PEPC催化的反应是光合作用的第一步，将二氧化碳固定为草酰乙酸，然后将其转运到细胞鞘细胞中进行光合作用。
这种C4途径有效地减少了光呼吸对植物光合作用效率的影响。
另外，在某些条件下，PEPC还可参与细胞的呼吸过程，将草酰乙酸转化为磷酸烯醇化合物，从而提供能量。
磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的活性受到多种因素的调节。
首先，PEPC的活性可通过调节其基因表达水平来实现。
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达
大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达作者：何晓亮李竹梁立强孟万利来源：《河北科技大学学报》2019年第02期摘要：为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的結构和功能，采用PCR（聚合酶链式反应）、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析，扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上，并导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。
通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。
关键词：基因工程;大肠杆菌;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;基因表达;二氧化碳中图分类号：Q812文献标志码：AAbstract：In order to better study the structure and function of phosphoenolpyruvate carboxylase， the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is cloned and expressed by PCR （polymerase chain reaction）， double enzyme digestion and cell transformation. The results showthat the new phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli is successfully amplified andcloned into the prokaryotic expression vector pET-30a， and then introduced into Escherichia coli BL21 expression system. The phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli is successfully induced by IPTG. The phosphoenolpyruvate carboxylase can be efficiently expressed by using the proposed method， which provides preparation for further scale expression， purification and application.Keywords：genetic engineering; Escherichia coli; phosphoenolpyruvate carboxykinase; protein expression; CO2磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一种存在于磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳反应生成草酰乙酸过程中的催化酶[1-3]。
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建
（ ． 山东农业大学农学院 ；２ １ ．作物生物学国家重点实验室 ，山东 泰安 ２ １ １ ） ７ ０ ８
摘要 ：磷 酸烯醇式丙酮酸羧化 酶 （ Ｅ Ｃ ｓ ）是控制植物籽 粒 中蛋 白质／ Ｐ Ｐ ａｅ 油脂 含量 比例的关键 酶。本研究 利用 Ｒ Ｐ Ｒ技术 ，克隆 Ｐ Ｐ ａｅ基因的 ｃ Ｎ Ｔ— Ｃ Ｅ Ｃｓ Ｄ Ａ片段 ，并将克隆 的 Ｐ Ｐ ａｅ 因片段反 向连接 替代植 物表达 载体 Ｅ Ｃｓ 基
ｐ Ｇ Ｅ 。为通过反 义抑 制技 术提高花生含油量提供 了基 因及 表达载体 。 Ｂ ＰＰ
关键 词 ：花生 ；Ｐ Ｐ羧化酶 ；Ｒ Ｐ Ｒ；反义表达载体 Ｅ Ｔ— Ｃ 中图分类号 ：Ｓ １．３ ８ ７ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ ０ ０—２２ （０ ０ ｌ ０ ０ —０ ３ ４ ２ １ ）Ｏ 一 ０ １ ５
（ ． Ａ ｒｎ ｍ ｏｌ ｅｏ ｈ ｎ ｏｇＡ ｃｌ ｒｌ ｎｖｒｔ；２ Ｓａ ｅ ａｏａ ｒ ｏ ｒｐＢｏｏｙ ，Ｔ ｉ ７ ０ ８，Ｃ ｉａ １ ｇｏｏ ｙＣ ｌｇ ｆ ａ ｄｎ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ ． ｔｅＫ ｙＬ ｂｒｔ ｙ ｆ ｏ ｉｌ ｅ Ｓ ｕ ｅｉ ｌ ｏ Ｃ ｇ ａａ ２ １ １ ｎ ｈｎ ）
Ｐ Ｉ２ Ｂ １ １的 Ｇ Ｓ基因。从花生栽培 品种荔蒲大花 生中克隆获得 编码 Ｐ Ｐ ａｅ基因 的 ｃ Ｎ Ｕ Ｅ Ｃｓ Ｄ Ａ片段 （ ８ ｐ ，测序 ８ ６ｂ ）
结果 显 示 其 核 苷 酸 序 列 与 已报 道 的 花 生 （ Ｕ ９ ６ ９ 、棉 花 （ Ｙ ０ ９ ９） Ｅ ３ １２ ） Ａ ０ ８ ３ 、大 豆 （ １７７） Ｄ ０ １ 、拟 南 芥
Ａｂｔａ ｔ ｈ ｓｈｅ ｏｐｒｖｔ ｃｒｏｙａｅ（ Ｅ Ｃ ｓ ）ｐａｓａ ｐ ｒ ｎ ｒｌ ｉ ｅｃｎｒｌ ｆｈ ａ ｏｏ ｅ ｓｒｃ ：Ｐ ｏｐ ｏｎ ｌｙｕ ａ ａｂｘ ｌ ｅ ｓ Ｐ Ｐ ａｅ ｌｙ ｎｉ ｏｔ ｔ ｏ ｔ ｏ ｔ ｅｒｔ ｆ ｈ ｍ ａ ｅｎ ｈ ｏｏｔ ｉ ｔ
植物细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的生物信息学分析
［5 ， 6 ］
1
1． 1
材料与方法
植物细菌型 PEPC 成员搜索
gov / ） 中， 利用拟南芥中的细菌型 PEPC 基因 Atppc4 （ 登录号： CAD58727 ） 的氨基酸序列作为检索 序列搜索相似的蛋白序列， 共得到百余条氨基酸 序列， 根据植物型 PEPC 与细菌型 PEPC 的差别， 即细菌型 PEPC 的 N 端没有含有丝氨酸残基的 酸性不变序列： － XX － SIDAQLR 和植物型 PEPC 的 C 端的倒数第 4 个保守氨基酸为谷氨酰胺 （ glutamine） ， 而细菌型 PEPC 则为 精 氨 酸 （ arginine） 或 赖 氨 酸 （ lysine ） 。 在 拟 南 芥 （ Arabidopsis thaliana） 、 花生（ Arachis hypogaea ） 、 油菜 （ Brassica napus ） 、卷 柏 （ Selaginella moellendorffii ） 、大 豆 （ Glycine max） 、 水稻 （ Oryza sativa japonica ） 、 云杉 （ Picea sitchensis ） 、 毛 果 杨 （ Populus trichocarpa ） 、 蓖麻 （ Ricinus communis ） 、 高粱 （ Sorghum bicolor ） 和葡 萄 （ Vitis vinifera ） 11 种 植 物 中 获 得 细 菌 型 PEPC 蛋白质序列， 其中有的植物中的一个细菌 型 PEPC 基因具有多种可变剪接形式， 编码不同 ， （ Selaginella moellendorffii ） 的细 的蛋白质 如卷柏 菌型 PEPC 基因有 4 种不同剪接形式， 编码 4 种 蛋白质， 大豆（ Glycine max ） 有 2 种， 蓖麻 （ Ricinus communis） 有 3 种， 但由于可变剪接所编码蛋白 质包含几乎相同的氨基酸序列， 在进一步的多序 列联配和系统进化的分析中总是排列在一起， 所 以仅选取其中信息完整一种形式， 共得到 11 条 植物细菌型 PEPC 蛋白质序列 （ 表 1 ） 。 从 NCBI CDS 和蛋白 数据库中分别下载其相应的核苷酸、 质序列。 2． 2 植物细菌型 PEPC 基因结构分析 分析候选的 11 种植物的 NCBI 的数据， 其中 5 种植物的细菌型 PEPC 基因目前只报道了编码
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建
河南农业科学，2018，47 (5):16-23Journal of Henan Agricultural Sciences d〇i：10. 15933/ki. 1004-3268.2018.05.004玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建曹路遥\周岩14，魏琦超\陈燕绘\陈亚东1!2,蔺一帆\田瑞婷1(1.河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡453003;2.河南省华隆生物技术有限公司，河南新乡453003)摘要：为了克隆磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶（P E PC ae)的编码基因以用于表达载体的构建，本研究根据已公开的序列信息设计特异性引物，以玉米自交系ZD410的叶片D C A为模板，通过P C R技术成功克隆了 D D基因的全长序列。
生物信息学分析发现，该基因完整0P F长度为2 913 bp，编码蛋白质分子质量约为108. 179 ku，等电点（PI)为5.73;对其氨基酸序列进行同源性检索分析显示，该蛋白质与其他C4植物的P E P C蛋白具有极高的同源性；利用Gateway技术构建含D D目的基因的表达载体，并通过农杆菌介导的花序浸染法将该基因导入野生型拟南芥。
关键词：玉米；磷酸晞醇式丙酮酸羧化酶基因；基因克隆；载体构建；拟南芥'遗传转化中图分类号：S513 文献标志码：A文章编号％ 1004 -3268(2018)05 -0016 -08Cloning 〇0 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene from Maize andConstruction of Its Expression VectorCAO Luyao1，ZH0U Yan1*，WEI Qichao1，CHEN Yanhui1，CHEN Yadong1，2，LIN Yifan1，T IT A N Ruiting1(1.School of Life Science and Technology，H enan In stitute of Science an d Technology/H enan Province CollaborativeIn novation Center of M od ern Biological Breeding，Xinxiang453003，China；2.H enan H ualong Biological Technology Co.，Ltd.，Xianxiang453003，China)Abstract%I n o nier to clone the encoding gene of phosjDhoenoljDyruvate carlDoxylase for use in the construction of expression vectors，specific primers were designed b ased on the publislied seque tion，and the leaf DNA of maize inbred line ZD410 was used as a template to succe length sequence of D D gene by PCR.Bioinformatics analysis showed that the length of the complete ORFwas 2 913 b p，the molecular weight of the encoded protein was about 108. 179 k u，and the isoelectricpoint was5. 73. The amino aci(d sequence coded of the gene was homologously showed that the protein was related to the PEPC of o tiier C4plants.Gateway technology wa struct an expression vector containing the target gene_p e$c，and the gene was introduced abidopsis through Agrobacterium tumefaciens-mediated inflorescence dip method.Key words%Maize;pepc gene;Gene cloning；Vector construction；Arabidopsis thaliana；Genetic transformation光合作用是地球碳-氧平衡的重要媒介，是植 物赖以生存的基础，也是决定作物产量高低的重要因素之一。
002植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其编码基因研究进展杨玲玲（化学与生命科学学院2009级食品质量与安全监测专业学号091004024）指导教师：蔡英卿副教授摘要：本文主要介绍了C4植物中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）及其编码基因在近年来的研究进展，以及对PEPCK的结构，功能,影响其活性的因素等方面进行讨论。
关键词：C4植物磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因光合速率磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK，EC4．1．1．49)催化如下的反应：OAA +ATP →PFP+ADP+CO2。
PEPCK主要作用是参与C4代谢途径的CO2固定作用。
其主要分布在C4植物的叶肉细胞的叶绿体内，形成CO2的浓缩机制为维管束鞘细胞的C3途径提供CO2。
近些年来利用生物技术已将编码该酶的基因(ppc)转移到C3作物中并得到了超量表达，因此，PEPCK成为改善C3作物光合作用重点关注的酶。
对PEPCK有两种形式：一种是存在于哺乳类、鸟类和昆虫等动物内的PEPCK．它利用GTP为底物，Mt 为70000 ；另一种存在于植物、细菌、酵母和藻类中，利用ATP作底物，这种PEPCK的蛋白质分子序列与动物中的不同。
植物的PEPCK与细菌、酵母和藻类的氨基酸序列比较接近，都有一个与ATP结合的保守序列，但来自植物的PEPCK 相对分子质量较太。
本文主要简述近年来对C4植物PEPCK的研究进展。
1 PEPCK的分布与定位1.1 PEPCK的分布1.2 PEPCK的定位2 PEPCK的蛋白结构和生理功能2.1 PEPCK的蛋白结构2.1.1相对分子质量2.1.2活化中心2.2 PEPCK的生理功能2.2.1 生糖作用2.2.2 浓缩CO22.2.3 细胞内的PH平衡2.2.4 其他作用3 PEPCK酶的调节3.1磷酸化调节3.2产物调节4 PEPCK的分子生物学4.1 PEPCK基因的结构特征4.2 PEPCK基因的克隆5 结语。
PEPCase在植物有机酸代谢中的研究进展
Ｖｏ ． ８ １３
Ｎｏ ．１
河 南 科 技 学 院 学 报 ｆ自 然 科 学 版 ）
２ １ 年 ３ 月 ００
Ｍａ ． ０ ０ ｒ２ １
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｎ Ｉ ｓｉｕ ｅ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＨｅ ａ ｎ ｔ ｔ ｆＳ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｔ
很 少发现ｆ Ｐ Ｐ ａｅ ２ Ｅ Ｃ ｓ 在植物代谢 中发挥着 重要 作用 ， 】 ． 本文就 其对植物有机 酸代谢 的调节作 用作 一综述．
在 于植物 细胞质 中的一种酶 ， 化磷 酸烯醇 式丙 酮酸 （ Ｅ ） Ｈ ０ － 生成 草酰 乙酸 和无机磷 ，以往 催 Ｐ Ｐ与 Ｃ ３ 反应
研究大多侧重 于 Ｐ Ｐ ａｅ在 Ｃ Ｅ Ｃｓ ４和 Ｃ Ｍ 植物光合代谢 中的关 键作用 ，而很少 涉及其在 Ｃ Ａ ４和 Ｃ Ｍ植物 Ａ
的非光合组 织 以及 在 Ｃ ３植物 的一些 用途… Ｐ Ｐ ａｅ主要存 在于高等植 物和 细菌 中 。 ．Ｅ Ｃ ｓ 在动物 和酵母 中
Ｋ ｅ ｒ ｓ Ｐ Ｐ ａｅ，ｒａ ｉ ａ ｉ ｔｂ ｌ ｍ ， ｅ ｎ ｙ ｙ ｗｏ ｄ ： Ｅ Ｃ ｓ ｏｇ ｎｃ ｃｄ ｍｅａ ｏｉ ｋ ｙｅ ｚｍｅ ｓ
磷酸 烯 醇式 丙 酮 酸羧 化 酶 （ｈ ｓｈ ｅ ｏ ｙ ａｅｃ ｒｏ ｙ ｓ ， Ｃ ．．．１ ， Ｐ ｏｐ ｏ ｎｌ ｍｖｔ ａｂ ｘｌ ｅ Ｅ ４１ ３ ） 简称 Ｐ Ｐ ａｅ 是广 泛存 ｐ ａ １ Ｅ Ｃ ｓ，
酸循 环 的 顺 利进 行 ， 控果 实有 机 酸 的合 成 与 转 化 ， 时 紧 密联 系植 物 体 内 的碳 氮代 谢 ． 述 了 Ｐ Ｐ ａｅ的生 调 同 论 Ｅ Ｃｓ 理 特 性 和 功 能 ， 其在 植 物 体 内有 机 酸代 谢 中 的关 键 作 用 ， 论 其 可 能存 在 的调 控 机 制 ． 时对 以后 的研 究 提 及 讨 同
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析
玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析王重;樊哲儒;张跃强;李剑峰;高新【摘要】Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained from Zea mays and analyze it by bioinformatics. [ Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were se-quenced and analyzed by bioinformatics.[ Result] The electrophoresis showed that the coding sequence( CDS) of PEPC gene in Zea mays was 2 913 bp and the polypeptide chains coded by PEPC included 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm.There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184;597-609 bits had two phos-phoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison.[ Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.%[目的]获得玉米的PEPC基因，并对其生物信息学进行分析。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)提取液
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)提取液简介：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4植物和CAM 植物固定CO 2的关键酶，为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。
大肠杆菌中的酶分子量约36万的四聚体，可受很多因素的影响，例如可为乙酰辅酶A 活化，可受天门冬氨酸抑制。
此酶是变构酶，主要功能为供给三羧酸循环以草酰乙酸，另外也与C4植物光合二氧化碳固定反应(C4二羧酸循环)及景天科植物的苹果酸形成(景天酸代谢)等有关。
Leagene 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、离心管或试管3、匀浆器或研钵4、低温离心机操作步骤(仅供参考)：1、取植物组织清洗干净，切碎。
2、加入预冷的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。
3、经纱布或滤纸过滤，留取滤液待用。
3、离心，留取上清液。
4、冻存，用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的检测或其他用途。
计算：组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%注意事项：编号名称CS0421Storage 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液500ml 4℃使用说明书1份1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶提取液稀释样品后重新测定。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关：编号名称CC0007磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)DC0032Masson三色染色液DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA)NR0001DEPC处理水(0.1%)PS0013RIPA裂解液(强)TC1167尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶pepc基因全长cDNA克隆及序列分析
（ ．Ｒ ｓａｃ ｓｔｔ ｏ ｕ ｔ ｐｃｌＦｒｓ ｙ ｈｎ ｓ ｃｄｍ ｏｅｔ ， ｕ ａｇ ３ ０ Ｚ ｅａ ｇ ｈｎ ； １ ｅｅｒｈＩ ｔｕｅ ｆ ｂｒ ｉ ｏｅｔ ，Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙＦｒｓ ｙ Ｆ ｙｎ １ ０， ｈｊ ｎ ，Ｃ ｉ ｎｉ Ｓ ｏ ａ ｒ ｒ １４ ｉ ａ ２ ｅｅｒｈＩｓｔｔ ｏ ｏ ｔ ，Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙＦｒｓ ｙ，Ｂ ｉｎ １０ ９ ，Ｃ ｉａ ．Ｒ ｓａｃ ｎｔｕｅ ｆ ￣ｓ ｙ ｈｎ ｓ ｃｄｍ ｏｅｔ ｉ Ｆ ｒ ｒ ｅ ｉｇ ０ ０ １ ｈｎ ） ｊ
中 图 分 类 号 ：７ ８４ ￥ １ ．６ 文献标识码 ： Ａ
Ｃｌ ｎ ｎｇ ａ ｑ ｎ ｅＡｎａｙ ｉ ｆＦｕｌ－ｅ ｔ ＤＮＡ ｆ ｏ ｉ ｎｄ Ｓｅ ｕｅ ｃ ｌｓｓｏ ｌｌｎｇ ｈ ｃ ｏ
ｐ ｐ ｎ ｒ ｍ ａ ｒｐｈ ｕ ｃ ｓ ｅ ｃ Ｇｅ ｅ ｆ ｏ Ｊ ｔｏ ａ ｃ ｒ ａ
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作 物 学 报
第 31 卷
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)的主要作 用是参与 C4 代谢途径的 CO2 固定作用 。 其主要分 布在 C4 植物的叶肉细胞的叶绿体内 , 形成 CO2 的浓 缩机制为维管束鞘细胞的 C3 途径提 供 CO2 。 近些
年来利用生物技术已将编码该酶的基因(ppc)转移 到 C3 作物中并得到了超量表达[ 1 , 2] , 因此 , PEPCase 成为改善 C3 作物光合作用重点关注的酶 。 对多种 植物的 ppc 序列和结构 已进行了详尽 解析[ 3 ～ 8] , 为 转 C4 基因作物的改造研究奠定了重要基础 。
根据已报道甘蔗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基 因 cDNA 全长序 列 , 设计 1 对引物 , 序 列为 P1 :5′ACT TCT AGA ATG GCG TCC GAG CGG CAC C-3′, P2 :5′-GTA GGT ACC CTA GCC GGT GTT CTG CA-3′。
以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 。 所用的 Taq 酶 为 Takara LA Taq , 反应程序采用两步法进行 , 94 ℃预 变性 5 min , 94 ℃变性 30 s 、70 ℃复性 30 s 、70 ℃延伸 3 min , 30 个循环 , 然后 70 ℃延伸 10 min 。 1.4 PCR 产物的克隆
(1 中国农业大学农学与生物 技术学 院 , 北 京 100094 ;2 中 国农业 科学 院作 物科 学研究 所 , 北 京 100081 ;3 北京 师范 大学 生命 科学 学院 , 北 京 100875)
摘 要 :为揭示 C4 野生植物稗草(Echinochloa crusgalli)PEPCase 的结构和功能特点 , 探索改善 作物高光效 新途径 , 克隆了 稗草(E.crusgalli)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的 cDNA 全长 , 测序及同源性比较分析结果证实 , 稗草 ppc 的 cDNA 全长为 2 886 bp, 编码 961 个氨基酸(GenBank 登录 号 :AY251482);核苷酸序 列与谷 子(Setaria italica)C3 型 、高 粱(Sorghum bicolor)C3-2 型 、玉米(Z ea mays)C3-2 型 、水稻(Oryza sativa)C3 型 磷酸 烯醇 式丙 酮酸 羧化 酶基 因的 同 源率 分别 达 94.8 %、 93.2%、93.0%和 89.7 %。 推导的氨基酸序列中 C 末端第 771 位氨 基酸是丙氨 酸(A), 表 明是一个 C3 型基因 。 与 其他植 物几种不同形式 PEPCase 进行的多重序列比对与系统进 化分析 结果也 证实 , 此基因 的核苷 酸序列 及其编 码的氨 基酸序 列与所有参与对比的 C3 型 序列的同源性均远远高于与 C4 型的同源性 。 与玉米 、高粱 C3-2 型 PEPCase 的同源性 分别高达 96.5%、96.4%, 与高粱 、玉 米的 C3-1 型 PEPCase 的同 源性 分 别为 84.3 %、83.8%, 而 与 谷子 、玉米 、甘蔗 和 高粱 的 C4 型 PEPCase 的一致性相对较低 , 分别为 82.2%、79.1 %、77.1 %和 76.6 %。 因此 进一步 推论新克 隆的 稗草 ppc 基 因属 于 C3-2 型 。 对其编码的蛋白序列进行了结构域 、活性位点和功能位点预测 。
基金项目 :国家重点基础研究和发展规划(973)项目 :作物高效抗旱的分子生物学及遗传学基础(2003CB114300);作物 抗旱的遗传学基 础 (2003CB114301)。 国家研究与开发专项(863):优质 、抗逆转基因新品种(系)的选育与转基因技术创新研究(JY03-B-11)。
作者简介 :张桂芳 , 女 , 博士 , 作物生理专业 。 ＊通讯作者 :赵明 , 男 , 博士 , 作物栽培专业 。Tel :010-68918752. Received(收稿日期):2004-10-20 , Accepted(接受日期):2005-01-18.
取光 照 4 h 后 的 稗 草 绿 叶 , 基 本 参 照 Trizol (Gibeco 公司)说明书方法提取总 RNA 。 cDNA 合成 反应 参 照 试 剂 盒 ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase (Promega 公司)程序 。 1.3 PCR 引物的设计与 PCR 合成
关键词 :稗草 ;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ;基因克隆与分析 中图分类号 :S451
Cloning and Characterization of Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene from
Echinochloa crusgalli
ZHANG Gui-Fang1, 3 , ZHAO Ming2, ＊ , DING Zai-Song2 , ZHANG Li1 , XIAO Jun-Tao1
PCR 产物经 1.0 %琼脂糖凝胶电 泳检查后 , 切 下目标带 , 用 PCR 产物纯化试剂盒(北京博大泰克 公司产 品)回收 DNA , 回收 的 PCR 产物与 pUCm-T
vector(上海 Sangon 公司)连接 。 1.5 测序及序列分析
第 31 卷 第 10 期 2005 年 10 月 1365～ 1369 页
作 物 学 报 ACTA AGRONOMICA SINICA
Vol.31, No.10 pp.1365 -1369 Oct., 2005
稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析