木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶基因xynⅠ的克隆和序列分析
ａ １ ｂ ｉｎ ｌ ｅ ｔ ｅｅ ｃ ｄｎ ｇｏ ， ｎ ６ ｐ ｍ ｔｒ ｐ ｐｉ ｎ ｏ ｉｇｒｇ ｎ ｗ ｉ ｎ ｏ ｅ ｅｘ ｌ ａｅ （ ｙ ）ｏ １ ｐ ｓ ａ ｐ ｐｉ ｎ ｏ ｉｇｒ ｉｎ ａ ｄ ａ５ ７ｂ ａｕｅ ｅ ｔ ｅ ｅ ｃ ｄｎ ｅ ｉ ｈｃ ｅ ｃｄ ｄ ｔ ｙａ ｓ Ｘ ｎ Ｉ ｆ １ ｇ ｄ ｅ ｄ ｏ ｈ ｈ ｎ
ｔ ｅ ｇ ｎ ｍ ｉ ｈ ｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｘｒ ｃ ｅ ｏ Ｅ００１ Ｔｈ ｅ ｔａ ｔ ｄ ｆ ｍ ｒ ． ｅ ＤＮＡ ｓ １０ ｐ ｉ ｅ ｇ ｈ ｗｈ ｃ ｎｃｕ ｄ ｈ ｅ ｉｎｓｏ ｒ ｍｏ ｅ ａ ｉ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ９８ ｂ ｎ ｌ ｎ ｔ ｉ ｈ ｉ ｌ ｄｅ ｔｅ ｒ ｇｏ ｆａ ｐ ｏ ｔ ｒ ｎ ｒ ｎ ｏ
Ｃｌ ｎ ｎ ， ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ Ａｎ ｌ ｓｓ ｏ ｈ ｙ ｃ ｄ ｎ ｏ ｉ ｇ ａ ｄ Ｓ ｑ ｅ ｃ ａ ｙ ｉ ｆｔ ｅ ｘ ｎ ＩＥｎ ｏ ｉ ｇ
Ｘｙ ｒ ｍ ｐｅｇ ｌｕ ｓ ｍｉ Ｅ ０１ ｎ Ｉ ｆｏ Ａｓ ｒ ｉ ｓ ｕ ａ ｉ Ｏ ｌ
曼
摘
Ｗ Ｕ ｎ—ｈｅ Ｍｉ ｅ ｎ
ｄ
邬敏辰 王时 良 ， ， 周晨妍
（ ．江南大 学 医药学院 ，江苏 无锡 ２ ４６ ； ．江南大学 生物 工程 学院 ，江苏 无锡 ２ ４ ２ ） １ １０ ３ ２ １ １２ 要 ： 以宇佐 美曲霉 Ｅ ０ ０ １总 Ｒ Ａ为模 板 ， 用 Ｒ － Ｃ Ｎ 采 Ｔ Ｐ Ｒ等技术扩增 了木 聚糖 酶基 因（ｙ ） ｘｎＩ 的
２ ｃｏｌ ｆ ｉ ｔｃｎｌｇ ，ｏｔｅｎＹ ｎ ｚ ｎｖｒｉ ， ｘ ２４ ２ ， ｈ ａ ．Ｓｈｏ ｏ ｏ ｅｈｏｏｙＳ ｕｈｒ ａ ｇ ｅＵ ｉｅ ｔ Ｗｕｉ １ １２ Ｃ ｉ ） Ｂ— ｔ ｓｙ ｎ
康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达
参考文献： ［ ］ ｏｒ １Ｖ ｈａＶ，Ｉ ａ ｈｔ ｃ８ｙ ，Ｄｙｌ ，ｅ ａ．Ｇ ｅｅｖｒ ｎ ｆ ｂｔ ６ ｒＢ ａ日ｌＩａＴ ａａ Ｓ ｔ １ ｏ ｔ ａｉ ｔ ｍｌ ｔｌ ｎ ｉ ａ ｓｏ ｅ ａ
—
ｌｅｏ ｌ ｔ ｉ ｅ ｅ ａ ｄ ｉ ｓ ｅａｉ ｗｉ ｍｉ ｏ ｘ ６ ｏ ｔ ｉ ｎ ｒｖ ｒ ｅ ａ ｔｇｏ ｄ ｎ ｇ ｎ ｎ ｔ ａ ｓ ｉｔ ｂ ｓ ｏ ｎ ｏ ｔ ｈ ｌ ｃ ｍｔ ￣ ｆ ｋ ｉ ｎ ｒ ｔ ｉｅｉ ａ ｓｉ ｎ
ｈｍａ［Ｊ ｕ ｏＪ ．Ｊｏ ｈ ｅ， ０６ ７ （）４９—５３ ａ－ ｓ ２Ｏ ， ３４ ：９ ０ ． ｙＲ
［］ ｍ ｃＣ Ｏｅ Ｙ ＢｌｏｕＭＳ Ｇ ｐｌ ２Ｆ ａ 。 ｎ ， ａ ｉｌ ． ∞ｅｃ ￣ ｄ ｉ ｒ ｃｇ ｅ
—
ｓ ｂｔ—ｌｔ ｍ０ ｅ ａ － ｆ ａ ｅ ｏ
ｇｏｕｉ ｇｎ ｎｎｔｅＴｒｉ ｈｅｐｂｃｄ［Ｊ Ｂｏ ｍｍＧｍ ｔ ２Ｏ ， ４７ ｌｂｌ ｅｅｉ ａｖ ｕｋ ｈｓ ｅ ｒ ｓＪ． ｉｄ ｎ ｉ ｓ ｅ ｍ ，Ｏ ５ ４ （
ｖ ｅ ｖ ｅａｄｅｐｉ ｉ 口 ｆｔ ｅ ｉ ｒｔ ｔ ｅｏ ｎｔ ｆ １ ｉ ，ｏｉ ｎ ａｒ ｅｍｌ ｐ ｃ ８ ｓ ｎｐｏ ｃ ｄｄｎｍｉ ｉ ０ ｏｉ ｎ ｎ ｎ ｋ ｍ ８ ｅｅ ａｏ ＂ ｎ 咖
ｃｅｓｓ ｙ ｅｓｄ ｈｓ ｉｈ ｅ ｏｍ ｎｅｌｕｄｄＩｌ Ｉ ｃ ｈ ｆｂｔ— ｈｅｅ ｂ 】 —ｐａｅｈ —ｐｒｒ ａｃ ｉ ｉ １ ｎ ∞ ａ ｙｏｅａ ［ ｅ ｇ ｆ ｑ Ｄ８ ｐ ｌｅ ｇ ｕｉ ［ 』ＪＯｎ ｍａｏｒＡ，Ｏ３ １１（ —２ ：１ 一ｌ８ ａｔ ｌ ｌ ｓＪ ． ＇ ｔｇ ２Ｏ ，０５ １ ） １１ １． ｏｏ ｎ ｂ ｏ ［］ ７ 梁梓， 王永 ， 郑玉 才， 草地 藏系绵 羊乳 的组成 及乳蛋 白多态性 等． ［］畜牧与兽医，Ｏ ６３ （） １ —１ ． Ｊ． ２０ ，８７ ：１ ４
宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达
Mar .200838 生物加工过程Chinese Journal of B iop r ocess Enginee ring第6卷第2期2008年3月宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn Ⅱ在不同毕赤酵母中的分泌表达周晨妍1,邬敏辰2,李东峰1,王 瑾1,王 武13(1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122;2.江南大学 医药学院,无锡214122)摘 要:将宇佐美曲霉E001的内切21,42木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pP I C9K 中,得到重组质粒pPXY 2N II,将其经Sa l Ⅰ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和K M 71,xyn Ⅱ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXG L98(M ut +)和PXK L29(M ut s)。
该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。
同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXG L98与PXK L29培养物上清液中的酶活力分别可达1156192U /mL 和1646103U /mL 。
关键词:宇佐美曲霉,内切21,42木聚糖酶基因,毕赤酵母,分泌表达中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1672-3678(2008)02-0038-05Secr eted expr e ssi on of A sperg illu s usam ii xyl ana se gene i n d i ffer en tP ich ia pas torisZHOU Chen 2yan 1,WU M in 2chen1,2,L IDong 2feng 1,WAN G J in 1,WANG W u1(1.The Key Lab oratory of I ndustrial B i otechnol ogy of the M i n istry of Educati on,Jiangnan Univ e rsity,W uxi 214122,Chi na;2.School of Medicine,J iangnan Univ e rsit y,W uxi 214122,Chi na )Abstra ct:The endo 21,42xylanase gene fr om Asperg illus usam ii E001wa s cloned int o the P ich ia pastoris expression vect or,pP I C9K,the recom binant p las m id was na m ed pPXY N II .The reco m binant pla s m id pPXY N II was linearized with Sa l Ⅰand then transfor m ed into P ic h ia pas toris GS115and K M71,res pec 2tively .The xyn Ⅱgene wa s in fr a m e integr a ted into the P ich ia genome thr ough ho mologous recom bination .The recom binant P ichia pastoris GS115(PXG L98)and K M71(PXK L29)secreted functional endo 21,42xylanase,and the enzy m atic activitie s reached 1156192U /mL and 1646103U /mL ,r e s pec tively .Key wor ds:Asperg illus usam ii ;endo 21,42xylanase gene;P ich ia pastoris ;secrected expressi on 植物纤维是自然界中最主要的可再生有机资源,在世界能源日益短缺的情况下,这些能源正越来越受到重视。
特异腐质酶Humicola insolens Y1耐热型木聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析
中图分类号 ： Ｑ ７ ８
文献 标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ８ ０８ － ４（ ６ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ ０１ － ２ １ ０８ －
Ｇｅ ｎ ｅ Ｃｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｅｎ ｚ ｙ ｍｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｔ ｙ ｏ ｆ
糖酶基 因 ｘ ｙ ｎ Ｄ。该 基因全长 １ １ ０ ４ ｂ ｐ ， 共编码 ３ ６ ７个氨 基酸 ， 不含 有 内含子 ， Ｎ端 的 ２ ２个 氨基酸 为信号肽 。
成熟蛋 白在毕赤酵母 中进行 了重组表达 ， 重 组蛋 酶学性 质 分析表明 ， ｘ ｙ ｎ Ｄ的最适 ｐ Ｈ为 ６ ． ０ ， 在ｐ Ｈ ４ ． ０～ ７ ． ０可以保 持 ８ ０ ％ 以上 的酶活性 ， 在ｐ Ｈ ５ ． ０一１ ０ ． ０具有 良好
中国农业科技导 报 ， ２ ０ １ ３ ， １ ５ （ ４ ） ： １ ２ １ —１ ２ ８
一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究
一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究魁红;罗会颖;董守良;姚斌【期刊名称】《中国农业科技导报》【年(卷),期】2010()5【摘要】利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。
该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。
将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。
重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。
对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。
【总页数】7页(P109-115)【关键词】Bispora;betulina;酸性木聚糖酶;毕赤酵母;酶活与稳定性【作者】魁红;罗会颖;董守良;姚斌【作者单位】兰州大学生命科学学院生物化学与分子生物学研究所,兰州730000;中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点开放实验室,北京100081【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究 [J], 马纳纳;徐冬冬;黄伟谦;游子娟;罗晓春2.来源于盐惰菌属Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究 [J], 于成野;韩红娟;付晓燕;游双红;孙淼;朱恒文;彭日荷;姚泉洪3.来源于Laceyella sp.的α-淀粉酶基因克隆、重组表达及酶学性质研究 [J], 赵海燕;宋晨斌;刘正亚;马兴荣;尚会会;李安华;关现军;王建设4.来源于瓶霉Phialophora sp. G5的酸性木聚糖酶基因的克隆及性质的研究 [J], 张帆;石鹏君;缪礼鸿;姚斌5.一种来源于Paenibacillus sp. A1的中性β-甘露聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究 [J], 刘小丹;杨培龙;刘永超;许修宏;孟昆;姚斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
东方肉座菌EU7—22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究
（ Ｅ Ｆ ０ ７ ９ ０ ６ １ ） 同源 性最 高达 到 ９ ３ ％； ｐ—ｂ ｘ ｌ 基 因与 里 氏 木 霉 ｐ—ｂ ｘ ｌ ｌ基 因（ Ｚ ６ ９ ２ ５ ７ ． １ ） 的 同 源 性 最 高达 到 ９ ４ ％ 。 生 物 信 息 学分 析表 明 内切 木 聚糖 酶 Ｉ 和 Ⅱ均 属 于 糖 基 水 解 酶 家 族 １ １ ， Ｎ末 端 前 １ ９个 氧 基 酸 均 为 信 号肽 。 内切 木 聚 糖 酶 １分 子 量 为 ２ ４ ． １ ３ ｋ Ｄ， 等 电点为７ ． ８ ７ ， 含 有 ３个 糖 基 化 位 点 ； 内切 木 聚 糖 酶 Ⅱ分 子 量 为 ２ ４ ． ４ ４ ｋ Ｄ， 等电点为４ ． ８ ６ ， 含有 １ 个糖基 化位点 ； Ｂ一木糖
摘
要： 东 方 肉座 菌 Ｅ Ｕ ７— ２ ２具 有 高产 半 纤维 素 酶 的 能力 。 根 据 已报 道 的 同属 里 氏木 霉及 绿色 木霉 木 聚 糖 酶 ， 木糖苷酶相 关
基因序列， 设计 Ｐ Ｃ Ｒ 引 物扩 增 出东 方 肉座 菌 内切 木 聚 糖 酶 （ Ｘ Ｙ Ｎ Ｉ， Ｘ Ｙ Ｎ １ Ｉ ） 及 ｐ一木 糖 苷 酶 （ ｐ—Ｂ Ｘ Ｌ ） 基 因。序列经 Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ Ｂ ｌ ａ ｓ ｔ 分析 ： 东 方 肉座 菌 ｘ ｙ ｎ Ｉ基 因与 里 氏木 霉 ｘ ｙ ｎ ｌ基 因（ Ｘ ６ ９ ５ ７ ３ ． １ ） 的 同源 性 最 高 达 到 ９ １ ％； ｘ ｙ ｎ Ⅱ基 因 与绿 色 木 霉 ｘ ｙ ｎ ２基 因
ｔ ｅ ｄ ｘ ｙ ｌ ａ ｎ ａ ｓ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｐ—ｘ ｙ ｌ ｏ ｓ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ ｒ ｍ ａ ｒ ｅ ｅ ｓ ｅ ｉ ａ ｎ ｄ Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ ｒ ｍ ａ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ｅ ．Ｔ ｈ ｅ ｘ ｙ ｎ Ｉ ａ ｎ ｄ ｐ—
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
木聚糖酶的基因克隆及表达
木聚糖酶（xylanase）主要包括β-1，4-木聚糖酶、β-1，4-木聚糖内切酶等，是指能够将木聚糖降解为低聚木糖或单糖的一组酶的总称。
木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物总糖的1／3，是自然界中除纤维素外含量最丰富的再生生物资源［1］。
木聚糖酶在饲料、造纸、食品、医药、能源等领域应用较广。
木聚糖酶广泛存于微生物中，目前已从不同来源的微生物中分离得到上百种木聚糖酶。
在自然界中，绝大多数野生型木聚糖酶的最适温度为40～60℃，酶活性不高，热稳定性较差［2］。
因此，研究者把研究重点放在了利用分子生物学手段对原始菌株的木聚糖酶基因进行克隆上，并对其进行表达，以期获得使用更加方便、特性更加优异的工程菌株。
本文对聚糖酶特性等进行了回顾，对其基因克隆和表达作一综述，并对分子生物学技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。
1木聚糖酶的研究现状国外对木聚糖酶的研究开始较早，生产技术及应用已趋于成熟。
研究者对细菌、真菌和放线菌木聚糖酶的研究更加深入和广泛，早在1992年就已经实现了木聚糖酶的工业化生产。
国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但发展迅速。
20世纪80年代初期，中国科学院微生物所张树政院士首先从海枣曲霉（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了木聚糖酶Ⅰ~Ⅳ，并深入研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。
目前，由于从这些野生型菌株中获得的木聚糖酶活性并不高，并且受到酶稳定性和底物特异性等方面的限制［2］，使研究者们将对木聚糖酶的研究重点放在了木聚糖酶基因克隆、表达和重组上，并在分子水平上对木聚糖酶进行改造。
木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展王丹丹1，2 综述，周晨妍1，付冠华1审校1.新乡医学院生命科学技术学院河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地，河南新乡453003；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453003 摘要：半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用，半纤维素是植物多糖的重要成分之一，而木聚糖则是半纤维素的主要成分。
木聚糖酶（xylanase）可催化木聚糖的水解，在各种生物体内均发现木聚糖酶。
在过去几十年中，已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶，以期改变宿主特性并适于商业应用。
本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达，并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望。
关键词：木聚糖酶；克隆；基因表达2木聚糖酶基因的克隆木聚糖水解酶系是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的真菌和细菌中。
已经报道的有细菌、真菌、酵母和放线菌等。
在国内外研究最多的还是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。
到目前为止，已经有上百种来自细菌和真菌等微生物中的木聚糖酶基因被克隆，并在不同的表达系统中成功表达。
从近几年克隆和表达出的木聚糖酶基因主要来自细菌、真菌、酵母和放线菌等，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。
从这些野生菌种克隆出的木聚糖酶基因在不同宿主菌中已成功实现了异源表达。
木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。
大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。
将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。
多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。
见表2。
3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。
能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提高
木聚糖酶基因的表达3.1木聚糖酶基因在原核细胞内的表达木聚糖酶基因在原核细胞内的表达以大肠埃希菌的研究为热点。
大肠埃希菌繁殖速度较快，是相对较理想的宿主细胞。
将克隆得到的目的基因和原核载体经双酶切，胶回收产物与重组质粒经连接酶连接，转化合适的大肠埃希菌，选择培养基筛选阳性克隆子，并进行诱导表达。
多数情况下，大肠埃希菌不但表达出目的蛋白，并且酶活力也有较大提高。
见表2。
3.2木聚糖酶基因在真核细胞中的表达大肠埃希菌虽然繁殖速度较快，但由于其为原核生物，细胞外有一层厚厚的细胞壁，必须先破碎细胞壁，才能将目的蛋白释放出来，而真核细胞克服了原核细胞的这个缺点，可将表达的目的蛋白分泌到细胞外,便于分离纯化。
能够表达木聚糖酶的真核细胞以酿酒酵母和毕赤酵母为代表，如水稻等真核细胞同样能够表达木聚糖酶，并且酶活也有一定程度的提。