小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性
人工合成六倍体小麦基因表达及三个酶活性变化的研究的开题报告
人工合成六倍体小麦基因表达及三个酶活性变化的研究的开题报告标题：人工合成六倍体小麦基因表达及三个酶活性变化的研究研究背景：小麦是重要的农作物之一，在全球粮食生产中具有重要的地位。
小麦在不同的环境条件下表现出多态性，其多样性主要来源于自然进化和人工杂交。
人工合成六倍体小麦通过多次杂交而得到，其基因组大小为二倍体小麦的三倍，可以改善小麦品种的产量、品质、抗逆性等性状，具有非常广阔的应用前景。
研究内容：本研究旨在分析人工合成六倍体小麦中基因表达及酶活性的变化。
具体研究内容如下：1. 通过转录组测序研究人工合成六倍体小麦中基因表达的变化，分析这些基因对生长发育和抗逆性的影响。
2. 分析人工合成六倍体小麦中三个酶活性的变化，包括淀粉酶、过氧化物酶和过氧化氢酶，以揭示其代谢途径的变化及对其产量和品质的影响。
3. 基于研究结果，探究人工合成六倍体小麦的产量、品质、抗逆性及适应性等方面的潜在机制。
研究意义：本研究可以揭示人工合成六倍体小麦的基因表达及酶活性变化，探索其在小麦品种改良方面的应用潜力。
同时，为研究小麦多样性及其进化机制提供一定的参考，同时可以启发人们对小麦多样化资源的开发和应用。
研究方法：1. 采集人工合成六倍体小麦植株，对其进行RNA提取，建立转录组测序库。
2. 对测序数据进行质量控制及数据预处理，得到清洁数据。
3. 通过拼接软件对清洁数据进行拼接，得到参考基因组。
4. 使用Bowtie2软件将拼接后的数据比对至参考基因组上，计算各基因的表达量及其差异性。
5. 对酶活性进行分析，采用分列色谱法测定淀粉酶和过氧化物酶的活性，并采用紫外线分光光度法测定过氧化氢酶的活性。
6. 统计和分析产量、品质、抗逆性等相关性状，并进行相关性分析。
预期成果：1. 给出人工合成六倍体小麦转录组的基因表达差异及其调控机制。
2.揭示人工合成六倍体小麦中三个酶活性的变化及其对小麦生长发育和抗逆性的影响。
3. 探究人工合成六倍体小麦的产量、品质、抗逆性及适应性等方面的潜在机制，并为小麦种质资源的开发和应用提供参考。
小麦基因克隆实验报告
一、实验背景小麦是世界上重要的粮食作物之一，其产量与品质直接关系到人类的粮食安全。
分蘖是小麦株型构成的一个重要因素，对小麦的产量有着直接的影响。
因此，克隆小麦分蘖调控基因，解析其分子机制和遗传网络，对小麦株型改良和分子设计育种具有重要的应用价值。
本研究旨在克隆小麦分蘖调控新基因TN1，并解析其分子机制。
二、实验目的1. 克隆小麦分蘖调控新基因TN1；2. 解析TN1基因的表达模式及调控分蘖的分子机制；3. 为小麦株型改良和分子设计育种提供理论依据。
三、实验材料与方法1. 实验材料小麦品种：偃展4110、济麦22、淮麦33和Fielder；突变体库：小麦甲基磺酸乙酯（EMS）突变体库；DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA测序试剂盒等。
2. 实验方法（1）突变体库构建以偃展4110、济麦22、淮麦33和Fielder为遗传背景，构建小麦甲基磺酸乙酯（EMS）突变体库，包含3万余份突变体。
（2）突变体筛选通过观察突变体分蘖数量和形态，筛选出少分蘖突变体tn1。
（3）基因克隆采用图位克隆方法，对tn1突变体进行基因克隆。
首先，通过PCR技术扩增tn1突变体基因组DNA片段；然后，将扩增产物与克隆载体连接，转化大肠杆菌；最后，通过菌落PCR和测序筛选出阳性克隆。
（4）基因表达分析通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测TN1基因在不同组织、不同发育阶段的表达水平。
（5）蛋白互作分析通过酵母双杂交（Y2H）技术，检测TN1蛋白与脱落酸受体TaPYL的相互作用。
（6）分子机制解析通过ABA处理实验，观察TN1基因对脱落酸信号转导路径的影响。
四、实验结果1. 克隆到分蘖调控新基因TN1通过图位克隆方法，成功克隆到tn1突变体的分蘖调控新基因TN1，该基因编码一个含有四个跨膜结构域的膜蛋白。
2. TN1基因的表达模式通过qRT-PCR技术，发现TN1基因在小麦茎基部和分蘖芽中高表达，且在不同发育阶段和不同组织中有差异表达。
小麦淀粉的理化特性及其合成的分子机制
小麦淀粉的理化特性及其合成的分子机制淀粉是小麦籽粒中最重要的组分，其含量直接影响粒重和产量，其理化特性是面条、馒头等蒸煮面食制品的主要决定因子。
因此，研究小麦淀粉理化特性及其合成的分子机制具有重要意义。
直链淀粉和支链淀粉分别占小麦总淀粉含量的17%~34%和66%~83%，以A型和B型2种颗粒形状存在，淀粉含量、直/支比、膨胀和糊化等理化特性显著影响了面条和馒头等蒸煮面食制品的加工品质。
小麦基因组中有26个基因编码了淀粉合成酶的亚基或同工酶，这些基因的表达在转录、转录后和翻译后修饰等水平上受到调控。
本文综述了小麦淀粉理化特性及其与面食制品品质之间的关系，小麦淀粉合成功能基因及其在转录水平调控、转录后调控和翻译后修饰等分子机制方面的最新研究进展，并对小麦淀粉研究的未来方向做了展望。
小麦是世界上两大口粮作物之一，35%~40%人口以其为主要食物来源，为人类提供了约20%的能量和蛋白质，在保障全球粮食安全中的作用远超过其他任何作物[1]。
中国是全世界第一小麦生产大国，小麦常年产量在1.38亿吨左右，稳居世界第一，人均小麦占有量近100千克，约占我国人均粮食的25%，在保障国家“口粮绝对安全”中具有极其重要的地位。
淀粉和蛋白是小麦籽粒两大主要组分，分别占籽粒干重的70%和12%左右，除直接影响粒重和产量高低外，其理化特性还分别是面条、馒头等主要蒸煮面食制品和面包、饼干等主要烘焙面食制品品质的主要决定因子[2]。
面条、馒头等蒸煮面食制品在我国小麦面粉消耗占比最高，达75%以上，在“中国的小麦要满足中国人的胃”中发挥了最重要的作用[3]。
虽然淀粉理化特性是影响面条、馒头等蒸煮面食制品品质的主要决定因子，但主要由于：(1)淀粉含量和特性测定过程复杂、耗时、昂贵、重复性较差[4]；(2)小麦淀粉理化特性的环境影响(36.16**)远大于基因型作用(4.86*)[5]，加之小麦基因组庞大(15.8 Gb)、序列重复性高(85%以上)和异源六倍体特性(2n = 6x = 42，AABBDD)，导致淀粉合成分子机制难以解析[6]；(3)目前，我国依据蛋白理化特性已经制定了强筋、中强筋和弱筋小麦品种审定标准，而淀粉理化特性指标尚未列入国家小麦新品种审定标准中[7]，故对淀粉理化性状研究普遍不够重视等。
小麦TaCOBL-5基因克隆及表达分析
小麦TaCOBL-5基因克隆及表达分析鲍新跃;陈红敏;王伟伟;唐益苗;房兆峰;马锦绣;汪德州;左静红;姚占军【期刊名称】《中国农业科技导报》【年(卷),期】2024(26)6【摘要】小麦产量关系我国粮食安全,干旱、低温、盐害和高温等非生物胁迫严重制约小麦产量增长。
前期转录组分析发现小麦TaCOBL-5D在多种非生物胁迫下差异表达。
克隆并获取TaCOBL-5D及其同源基因TaCOBL-5A、TaCOBL-5B,并对其生物信息学特性及表达模式进行了分析。
结果显示,TaCOBL-5与其他物种的COBL基因在基因结构、蛋白三级结构、保守结构域以及启动子调控元件方面表现出明显的保守性。
TaCOBL-5在根部表达量最高,并对各种非生物胁迫响应不同,尤其是在干旱胁迫下调控显著,表明其在干旱胁迫中的重要性,同时对低温、高温和盐胁迫也有不同响应。
此外,TaCOBL-5D基因在不同干旱抗性及高温抗性材料中表达量差异显著,进一步暗示其在逆境胁迫中具有重要作用。
这些研究结果有助于理解COBL基因在小麦中的功能,同时为小麦抗逆育种提供科学支持。
【总页数】11页(P11-21)【作者】鲍新跃;陈红敏;王伟伟;唐益苗;房兆峰;马锦绣;汪德州;左静红;姚占军【作者单位】河北农业大学农学院;北京市农林科学院杂交小麦研究所;濮阳市现代农业发展中心【正文语种】中文【中图分类】S512【相关文献】1.小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析2.蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3＇5＇-羟化酶基因3＇末端的克隆和表达分析3.小麦TaWRKY51基因的克隆、表达分析和转基因功能鉴定4.小麦近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表达分析5.小麦条锈菌PsCdc2基因的克隆及在条锈菌侵染小麦后的转录表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小麦耐热性鉴定及热激蛋白基因的克隆与表达分析的开题报告
小麦耐热性鉴定及热激蛋白基因的克隆与表达分析
的开题报告
一、研究背景
小麦是我国重要的粮食作物之一，但由于气候变化以及人类活动等因素，小麦种植地区温度逐渐升高，胁迫小麦的生长和产量。
小麦要适应高温胁迫，需要从生理和分子层面进行反应和调节，其中热激蛋白在这个过程中扮演着重要的角色。
因此，研究小麦的耐热性以及与之相关的热激蛋白基因是十分必要的。
二、研究目的
本研究的主要目的有以下两个方面：
1.通过小麦品种间的对比分析，筛选出耐热性较强的品种；
2.克隆小麦中参与耐热性的热激蛋白基因，分析其表达水平及调控机制。
三、研究内容与方法
1.小麦耐热性鉴定
将不同种植地区的小麦品种进行耐热性鉴定，通过叶片相对电导率和叶绿素荧光参数等生理指标对比分析，筛选出耐热性较强的品种。
2.基因克隆
从耐热性较强的小麦品种中提取总RNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术克隆出热激蛋白基因。
将克隆出的基因进行测序，进行进一步的生物信息学分析。
3.基因表达分析
通过qRT-PCR技术分析热激蛋白基因在不同小麦品种及不同的高温处理条件下的表达水平。
同时，采用亚细胞定位技术分析热激蛋白的分布情况，探究其调控机制。
四、预期结果
本研究将筛选出耐热性较强的小麦品种，探究热激蛋白在小麦耐热性中的调控机制，为小麦品种的选育以及提高小麦的耐热性提供理论基础和参考。
小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1290−1293/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 中国博士后科学基金项目(20060390773); 河南省教育厅自然科学基金项目(2006210007)作者简介: 康国章(1971–), 男, 从事作物分子生理研究; 王永华(1973–), 男, 从事作物生理研究。
**共同第一作者。
*通讯作者(Corresponding author): 郭天财(1953–), 博士生导师, 从事作物生理研究。
E-mail: gmzx-guo@ Received(收稿日期): 2007-10-22; Accepted(接受日期): 2008-01-24.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01290小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析康国章**王永华**刘超沈丙权郭天财*朱云集(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心, 河南郑州450002)摘要: 从大粒型小麦品种豫教2号中克隆出调控小麦ADPG焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSU I)cDNA全长。
在花后15 d的小麦植株中, 通过半定量PCR法, 发现LSU I基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高, 但在根和茎中表达量较低, 表明在绿色光合功能器官和淀粉合成器官中, LSU I基因量表达较高。
比较了LSU I基因在千粒重不同的豫教2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后, 发现在籽粒形成期, LSU I基因在两品种籽粒内表达相似, 但在籽粒灌浆期和成熟期间, LSU I基因在千粒重较高的豫教2号内表达量明显高于千粒重较低的兰考矮早八, 这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似, 表明LSU I基因的表达量可能与淀粉的积累量密切相关。
关键词: 小麦; AGPase胞质型大亚基; 基因克隆; RT-PCR; 基因表达Cloning and Expression of AGPase Cytoplasmic Large Subunit Gene in Common WheatKANG Guo-Zhang**, WANG Yong-Hua**, LIU Chao, SHEN Bing-Quan, GUO Tian-Cai*, and ZHU Yun-Ji (Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China)Abstract: The 1941-bp full cDNA sequence (GenBank No. DQ839506) of LSU I, the cytoplasmic large subunit gene I of adenosine 5' diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase), was cloned from a high 1000-grain weight wheat (Triticum aestivum L.) cultivar Yujiao 2. Semi-quantitive PCR analysis showed that LSU I expressed higher in leaves, glumes, sheaths, and grain than in roots and stems, indicating that LSU I expressed actively in photosynthetic and starch synthesis-related organs. During the primal period of grain development (5–10 d after thesis), there was no difference in transcript levels of LSU I gene between Yujiao 2 and Lankao Aizao 8 (low 1000-grain weight), but the transcript amounts in grains of Yujiao 2 was markedly higher than that of Lankao Aizao 8 at grain filling and maturity stages. The changes of LSU I gene expression were similar to the trend of starch accumulation in the two cultivars, suggesting that LSU I gene may be associated with starch accumulation in common wheat.Keywords:Triticum aestivum L.; Cytoplasmic large subsuit gene I of AGPase; Gene cloning; RT-PCR; Gene expression小麦的产量由单位面积穗数、穗粒数和千粒重三要素构成。
小麦TabHLH112-2B_基因克隆及每穗小穗数相关功能标记开发
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2024, 50(2): 403 413 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail:***************DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.31016小麦TabHLH112-2B基因克隆及每穗小穗数相关功能标记开发范子培1,2李龙2史雨刚1孙黛珍1,*李超男2,*景蕊莲21 山西农业大学农学院, 山西太谷 030801;2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081摘要: bHLH (basic Helix-Loop-Helix)转录因子在植物生长发育过程中发挥着重要作用。
本研究克隆了小麦TabHLH112-2B, 该基因由7个外显子和6个内含子构成, 编码444个氨基酸, 在315~364位氨基酸处具有一个典型的HLH保守结构域。
组织表达模式分析表明TabHLH112-2B在小麦幼苗期、拔节期、抽穗期和开花期的各个组织中均有表达, 其中在叶和根中表达量较高。
顺式作用元件分析发现TabHLH112-2B启动子区含有植物激素应答、胁迫响应、与分生组织发育相关的多种顺式作用元件, qRT-PCR结果显示其表达响应ABA、IAA、MeJA等植物激素和干旱、高盐、低温、高温等胁迫处理。
基因组序列多态性分析检测到启动子区域的2个SNP, 分为2种单倍型。
根据SNP-682开发分子标记并进行关联分析, 发现该标记与干旱、高温等多种环境下的每穗小穗数显著相关,Hap-2B-2为每穗小穗数多的优异单倍型。
研究结果为培育高产广适小麦新品种的分子标记辅助育种提供了优异基因资源和技术支撑。
关键词:小麦; TabHLH112-2B; 分子标记; 关联分析; 每穗小穗数; 优异单倍型Cloning of TabHLH112-2B gene and development of its functional markerassociated with the number of spikelet per spike in wheatFAN Zi-Pei1,2, LI Long2, SHI Yu-Gang1, SUN Dai-Zhen1,*, LI Chao-Nan2,*, and JING Rui-Lian21College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, ChinaAbstract: The bHLH (basic Helix-Loop-Helix) transcription factor plays an important role in plant growth and development. Inthis study, wheat gene TabHLH112-2B was cloned, which consists of seven exons and six introns, encoding 444 amino acids, andhas a typical HLH conserved domain at 315–364 amino acids. The tissue expression pattern analysis showed that TabHLH112-2Bwas expressed in all tissues at seedling stage, jointing stage, heading stage, and flowering stages. Among them, the relative ex-pression levels in leaves and roots were higher. The cis-acting element analysis showed that the promoter region ofTabHLH112-2B contained a variety of cis-acting elements related to plant hormone responses, stress responses, and meristemdevelopment. The qRT-PCR exhibited that the relative expression level of TabHLH112-2B was responsive to plant hormones (suchas ABA, IAA, MeJA) and abiotic stresses (such as drought, salt, low and high temperatures). Two SNPs were detected in its pro-moter region by genomic sequence polymorphism, which were classified into two haplotypes. A molecular marker was developedbased on SNP-682, and association analysis showed that the marker was significantly correlated with the number of spikelet perspike in various environments such as drought and high temperature. Hap-2B-2 was a favorable haplotype with more spikelets perspike. These results of this study provide the valuable genetic resources and technical support for molecular marker-assistedbreeding of wheat varieties with high yield and wide adaptability.Keywords: wheat; TabHLH112-2B; molecular marker; association analysis; the number of spikelet per spike; favorable haplotype本研究由国家重点研发计划项目(2022YFD1200201)和财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(小麦, CARS-03-5)资助。
小麦TaPDK基因的克隆、原核表达及纯化
小麦TaPDK基因的克隆、原核表达及纯化一、本文概述本文旨在克隆小麦中的TaPDK基因，并研究其在原核表达系统中的表达及纯化过程。
TaPDK基因是小麦中一种重要的酶，其在植物的生长、发育和逆境响应过程中发挥着关键作用。
本文首先通过生物信息学分析，确定了TaPDK基因的序列特征，并设计了相应的引物进行PCR扩增。
接着，将扩增得到的TaPDK基因片段克隆到原核表达载体中，并转化到大肠杆菌中进行表达。
通过优化表达条件，实现了TaPDK 基因的高效表达。
通过亲和层析和离子交换层析等步骤，对表达产物进行了纯化，得到了高纯度的TaPDK蛋白。
本文的研究结果不仅为深入了解TaPDK基因的功能和应用奠定了基础，也为小麦的遗传改良和分子育种提供了新的思路和方法。
二、材料与方法选择健康且生长良好的小麦（Triticum aestivum L.）作为实验材料，确保植株无病虫害，生长环境适宜。
PCR引物、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞、蛋白表达载体、IPTG （异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、Ni-NTA琼脂糖凝胶等购自相应供应商。
PCR仪、凝胶电泳仪、离心机、恒温摇床、超声破碎仪、蛋白纯化仪等。
根据小麦TaPDK基因的序列信息，利用生物信息学软件设计特异性引物，并添加适当的酶切位点。
提取小麦总RNA，反转录得到cDNA，以此为模板进行PCR扩增，得到TaPDK基因的全长序列。
将PCR产物与克隆载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证。
将测序正确的TaPDK基因与蛋白表达载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行质粒提取。
将表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落进行扩大培养。
在适当条件下加入IPTG进行诱导表达。
利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和层析，收集洗脱液并进行透析，去除杂质，得到纯化的TaPDK蛋白。
小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化
小麦 Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ２基 因克 隆 、 表达载体构 建及转化
张照贵 ， 李冰 ， 王佳佳 ， 张桂 芝 ， 李斯深
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｓ ｕ ｃ ｒ ｏ ｓ ｅ ｎ ｏ ｎ— ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｊ—ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ２（ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ）ｇ ｅ ｎ ｅ ｆ ａ ｍ ｉ ｌ ｙ ｍ ｅ ｍ ｂ ｅ ｒ ｓ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｉ －
（ 山东 农 业 大 学作 物 生 物 学 国 家 重 点 实 验 室／ 山东省作物生物学重点实验室 ， 山东 泰 安 ２ ７ １ ０ １ ８ ）
摘
要： Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２基因家族成员参与蛋 白质 的磷 酸化 ， 在植 物抵御非 生物胁迫 方面发 挥重要 的作用 。本研
究 以水稻 Ｓ Ａ Ｐ Ｋ ２基 因序列 为基础 ， 通过 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ技术克隆得到一个新 的小麦 Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２基 因， 命名为 Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２ ，
并提交到 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ （ 登录号 ： Ｋ Ｊ ８ ５ ０ ２ ５ ３ ） 。Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２基 因全 长 ４ １ １ ８ ｂ ｐ ， 由 ９个 外 显 子 和 ８个 内含 子 组 成 ， 包
含一个 １ ０ ２ ６ ｂ ｐ的开放 阅读框 ， 编码 ３ ４ １ 个 氨基酸 。Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２基 因序列在禾本科植 物 中高度保守 ， Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２ 与水稻 Ｓ Ａ Ｐ Ｋ ２以及玉米 Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２亲缘关系较近 。Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２基 因编码 的蛋 白质分子 量为 ３ ８ ． ６ ４ ｋ Ｄ， 理论 等 电点 为 ５ ． ４ ５， 含有 Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２基 因家族典 型 的丝氨酸／ 苏 氨酸蛋 白激 酶保守 结构 域和 多处磷 酸化位 点。构建 了 Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２基 因过表达载体 ， 转化 拟南芥 ， 获得转基 因植 株 ， 通过 Ｒ Ｔ— Ｐ Ｃ Ｒ方法检 测到 Ｔ ａ Ｓ ｎ Ｒ Ｋ ２ ． ２基 因在 拟
小麦TaTVP1_基因的克隆与表达分析
小麦TaTVP 1基因的克隆与表达分析马燕斌1,李换丽1,文晋1,王霞2,周仙婷1,王新胜1(1.山西农业大学/山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;2.运城学院,山西运城044000)摘要㊀[目的]发掘并研究小麦TaTVP 1基因响应耐盐㊁耐旱等非生物胁迫的功能与机制,为小麦抗逆育种提供新的基因资源㊂[方法]利用PCR 技术克隆小麦TVP 1基因,扩增获得cDNA 全长序列,并对其进行生物信息学分析,进一步利用qRT -PCR 技术分析其表达模式㊂[结果]小麦TVP 1基因全长2289bp ,编码762个氨基酸;其氨基酸序列具有12个跨膜结构,该结构中疏水氨基酸具有高度保守性,且肽链N 末端与C 末端均位于膜外,预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D 结构蛋白,推测与其具有的H +离子泵通道功能密切相关;系统发育树分析表明,TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高,该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR 分析表明,小麦中TVP 1基因在根㊁茎中的表达量要明显高于叶㊁穗中,具有组织特异性,且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异,这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关㊂[结论]克隆并分析了小麦TaTVP 1基因,为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础㊂关键词㊀小麦;TVP 1基因;生物信息分析;表达模式分析中图分类号㊀S 512.1㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀0517-6611(2023)17-0087-05doi :10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.019㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID):Cloning and Expression Analysis of TaTVP 1Gene in WheatMA Yan-bin ,LI Huan-li ,WEN Jin et al㊀(Shanxi Agriculture University /Institute of Cotton Research,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Yuncheng,Shanxi 044000)Abstract ㊀[Objective]To explore and investigate the functions and mechanism of TaTVP 1genes in wheat in response to abiotic stresses such as salt,drought tolerance,and provide a new genetic resources for wheat stress resistance breeding.[Method]In this study,we cloned the wheat TVP 1gene by PCR,amplified the full-length cDNA sequence,and performed the bioinformatic analysis,and further analyzed the ex-pression pattern by qRT-PCR.[Result]TVP 1gene in wheat is 2289bp and encodes 762amino acids which containing 12transmembrane structures,in these structures,hydrophobic amino acids are highly conserved,and both the peptide chain N and C terminal are located outside the membrane,it is predicted that the transmembrane structure could form a high-level 3D structure protein with obvious pore,which may be closely related to its H +pump channel function;phylogenetic tree analysis indicates high homology of TaTVP 1to monocot TVP 1proteins,and two distinct groups I and II could be classified between monocotyledons and dicotyledons during the evolution of the type of TVP 1genes;quanti-tative PCR analysis showed that the expression of TVP 1gene in roots and stems was significantly higher than that in leaves and ears,with tis-sue specificity,and the expression trend of this gene in the same tissue was also different between different materials,this may be related to the difference in drought resistance and other stress resistance among different materials.[Conclusion]In this study,the TaTVP 1gene was cloned and analyzed,which laid a foundation for further clarifying the mechanism of this gene involved in protection against abiotic stresses.Key words ㊀Triticum aestivum ;TVP 1gene;Bioinformatic analysis;Expression pattern analysis基金项目㊀山西省应用基础研究面上项目(202103021224145);山西省农业科学院农业科技创新研究课题(YGJPY2007);运城市科技局项目(YCKJ -2021023)㊂作者简介㊀马燕斌(1978 ),男,山西清徐人,副研究员,博士,从事作物分子遗传育种研究㊂收稿日期㊀2023-03-21㊀㊀土壤盐碱化等非生物胁迫是导致小麦等农作物减产的主要因素之一,土壤中过高的钠离子浓度会破坏胞内的离子平衡,造成作物体内的代谢途径紊乱,从而抑制其生长㊂为降低盐碱逆境对农作物产量的影响,除改良土壤外,培育耐盐碱农作物品种也可有效抵御土壤盐碱化等不利影响,进而在一定程度上稳定农作物产量㊂多年来,传统遗传育种与分子改良相结合极大地促进了研究人员选育具有耐盐碱㊁耐旱等特性种质资源的效率[1-2]㊂近年来,作物中多种耐旱㊁耐盐碱的基因被克隆鉴定并证实有助于改良作物的耐逆特性㊂H +转运无机焦磷酸酶(H +-PPase,TVP)是一种广泛存在于生物体内的H +转运酶,可作为调解细胞酸度的质子泵,驱动各种离子在液泡内的区隔化,同时也参与了调解植物生长素的运输,在植物环境耐受性㊁生长发育过程中都可能起到了作用[3]㊂有报道称,大豆GmVP 1基因能提高转基因大豆发状根在一定条件下对盐胁迫的反应[4];TPSP 融合基因在小麦中的表达可表现出较强的耐旱性[5];烟草中敲除NtMYB 68转录因子能改善烟叶中紫黄质的堆积,促进脱落酸的合成,从而改善烟株的抗旱性[6];拟南芥中过表达白菜Bp -NFYA 5㊁番茄sly -miR 397基因可以提高其干旱耐受性[7-8];外源基因玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的过表达,可使玉米耐旱性增强[9];GhPNP 1可通过cGMP 信号途径正向调解棉花对干旱的耐受性[10];大豆中的BADH 基因也表现出较强的抗旱性[11];此外,植物耐旱密切相关的还有DREB 类等基因[12-13];细胞质膜蛋白SOS1和液泡膜蛋白NHX 协同作用,使胞质内维持低浓度盐离子,从而提高了植物的抗盐性[14-16]㊂综上所述,各类不同基因的研究极大地丰富了耐旱㊁盐碱基因研究的理论基础,同时也说明作物耐旱㊁盐碱机理可能具有更复杂的多途径调控网络㊂因此,还需对植物的耐盐㊁耐旱性进一步探索,从更多的抗逆性作物着手,挖掘更多相关基因,从细胞㊁组织和整体水平上阐释植物耐干旱㊁盐胁迫的信号调控机制,进而为作物的遗传改良奠定基础㊂现有的研究已有很多关注小麦抗逆材料的创制及其分子机制的解析,笔者以小麦耐旱品种晋麦47和舜麦1718为材料,对其TVP 1基因进行克隆鉴定,并利用生物信息学对该蛋白进行理化性质㊁跨膜结构㊁保守安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(17):87-91㊀㊀㊀结构域和发育进化等方面进行分析,旨在为进一步研究该基因的功能与机理打下基础,同时也为利用该类基因进行植物耐逆优良种质选育提供科学参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀试验材料㊀供试材料晋麦47(JM47)㊁舜麦1718 (SM1718)均为山西省农业科学院棉花研究所国审品种,种植于山西省农业科学院棉花研究所试验田㊂1.2㊀材料处理㊀将晋麦47(JM47)㊁舜麦1718(SM1718)2种品种小麦籽粒浸泡在经过高压灭菌的蒸馏水中,过夜萌发,次日挑选生长状态一致饱满的种子,播种于土壤条件相同的花盆中,在22ħ恒温培养箱中进行培养,长日照7d,取苗样液氮速冻,于-80ħ保存,供DNA提取之用㊂小麦在温室盆栽中生长至幼穗阶段时,取根㊁茎㊁叶㊁穗4个组织样品于无RNA酶离心管中,液氮速冻以备RNA提取㊂1.3㊀总DNA提取、RNA提取和cDNA制备㊀DNA按照GENEOUTTM Plant DNA Isolation Kit(LABGENE,上海)试剂盒的说明书进行提取,-20ħ保存㊂小麦材料及其不同组织样品在液氮低温下冷冻磨成样品,分别称取约0.1g样品粉末,加入Trizol试剂(Invitrogen,USA)进行RNA提取,整个试验过程严格按照操作要求进行,避免RNase污染㊂利用分光光度计测定各样品RNA浓度㊁纯度后,以RNA为模板,参考RNA反转录试剂盒GoScriptTM Reverse Transcription Mix, Oligo(dT)(Promega,上海)说明书,合成cDNA第1链,于-20ħ冰箱保存㊂1.4㊀TaTVP1基因的克隆㊀从NCBI数据库下载TaTVP1 (AY296911.1)基因CDS序列,利用Primer Premier6.0软件根据该基因保守序列设计克隆特异性引物,引物由北京奥科生物科技公司合成,序列分别为TaTVP1-F:5ᶄ-CATG-GCGATCCTCGGG-3ᶄ,TaTVP1-R:5ᶄ-CTAGATGTACTTGAAC -3ᶄ㊂以晋麦47和舜麦1718幼苗的cDNA分别为模板,利用Ex Taq酶(Takara,上海)扩增TaTVP1基因的全长序列㊂反应条件为:94ħ预变性4min,94ħ变性40s,60ħ退火40s, 72ħ延伸2min,终延伸10min,30个循环㊂PCR产物经浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测,按照DNA纯化回收试剂盒(Omega Bio-Tek,美国)说明书回收片段,进行克隆㊂1.5㊀蛋白结构分析㊀利用SOSUI软件预测分析TaTVP1蛋白的跨膜结构域;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel. /interactive)对TaTVP1蛋白的三维结构进行在线预测㊂1.6㊀进化关系分析㊀从NCBI网站blastp分析并下载与TaTVP1氨基酸序列同源性较高的其他物种的氨基酸序列,利用Clustal工具进行多序列比对,MEGA5.0软件分析进化关系,利用Neighbor-Joining算法构建进化树,Bootstrap分析1000次㊂1.7㊀TaTVP1基因的组织表达分析㊀利用Beacon Designer 软件,参照TaTVP1基因序列,选择基因保守区设计特异性的荧光定量引物,内参基因为小麦Actin基因引物(表1)㊂按照SYBR Premix Ex Taq TMⅢ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)说明书,采用Applied Biosystems Step OnePlusTM仪扩增, PCR体系25μL,扩增程序为:95ħ预变性4min,95ħ变性5s,60ħ退火20s,72ħ延伸10s,循环40次㊂设置3次重复㊂数据处理采用2-ΔΔCt法计算相对表达量㊂表1㊀定量PCR分析使用引物序列Table1㊀The sequence of primers used for real-time PCR引物Primers序列Sequences(5ᶄ 3ᶄ)预期大小Expected sizeʊbp TaActin-F GGTGATGAGGCGCAGTCCAAG386 TaActin-R CGACCAGCGAGATCCAAACGATaTVP-F TCAGACTGCCACAAGGC160 TaTVP-R CTAGATGTACTTGAAC2㊀结果与分析2.1㊀TaTVP1基因全长的克隆㊀以晋麦47(JM47)㊁舜麦1718(SM1718)的cDNA为模板,扩增克隆均得到全长2000余bp的TaTVP1基因片段(图1),纯化回收产物,连接克隆载体pMD19-T转化至Trans-T1感受态细胞,随机挑取长势较好的菌落,经菌液PCR检测,筛选出阳性克隆,送至北京奥科生物科技公司测序㊂结果显示,TaTVP1基因序列全长2289bp,推测编码762个氨基酸㊂注:M.5000DNA Marker;1.晋麦47材料扩增的TaTVP1片段;2.舜麦1718扩增的TaTVP1片段㊂Note:M.5000DNA Marker;1:TaTVP1amplified fragment from JM47;2.TaTVP1amplified fragment from SM1718.图1㊀TaTVP1基因的PCR扩增Fig.1㊀PCR amplification of TaTVP1gene2.2㊀小麦TaTVP1的系统进化树分析㊀通过NCBI网站中blastp在线工具对TaTVP1氨基酸序列进行同源性搜索,选取相似性较高的多个作物TVP1氨基酸序列与TaTVP1进行比较分析,利用MEGA软件构建系统进化树,结果显示(图2),各作物TVP1蛋白在进化中分化成两大类,一类是大豆㊁拟南芥㊁棉花㊁烟草聚为一簇的双子叶植物TVP1Ⅰ类;另一类是小麦㊁玉米㊁水稻㊁青稞㊁大麦草TVP1聚为一簇的Ⅱ类,其中小麦TVP1蛋白与水稻㊁玉米等禾本科单子叶植物TVP1蛋白的遗传距离最近㊂这说明TVP1蛋白在单双子叶植物中的遗传分化明显㊂88㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年注:作物分别为拟南芥(AB015138)㊁油菜(JN940184㊁JN940185)㊁大豆(AK286008)㊁棉花(HM370494)㊁烟草(DQ630713)㊁甜菜(L32792)㊁番茄(AB300442)㊁葡萄(AJ5572565)㊁短芒大麦草(AY255181)㊁青稞(AB032839)㊁玉米(NM001111910㊁BT066389)㊁水稻(D45384)㊁小麦(AAP55210)㊂Note:The crops are Arabidopsis (AB015138),Rape (JN940184,JN940185),Cotton (HM370494),Soybean(AK286008),Tobacco (DQ630713),Sugar beet (L32792),Tomato (AB300442),Grape(AJ5572565),Short awn barley grass(AY255181),Highland bar-ley(AB032839),Corn(NM001111910,BT066389),Rice(D45384),Wheat(AAP55210).图2㊀小麦TaTVP1与其他植物TVP1的系统进化树分析Fig.2㊀Phylogenetic tree of predicted a mino acid sequences fromwheat TaTVP1and other plant TVP12.3㊀TaTVP1蛋白的跨膜结构预测分析㊀利用SOSUI 软件对TaTVP1蛋白进行跨膜结构预测分析,表明TaTVP1蛋白的氨基酸序列包含12个疏水跨膜结构域(图3)㊂亚结构域分析显示,小麦TVP1蛋白分为2个独立的结构,一个是N 端,包含4个疏水的跨膜区域,另一端是C 端,包含8个疏水跨膜区域,其多肽链的N 端和C 端均在膜外㊂2.4㊀TaTVP1跨膜氨基酸序列比对分析㊀小麦TVP1编码762个氨基酸,由该氨基酸序列(图4)包含的12个跨膜结构域(I -XII)序列的分析和比较可知,小麦TVP1与拟南芥㊁水稻各跨膜区中保守氨基酸一致的分别为10㊁13㊁15㊁19㊁21㊁20㊁13㊁19㊁21㊁19㊁25及17个,各跨膜区疏水氨基酸的个数依次为16㊁15㊁12㊁13㊁11㊁13㊁14㊁15㊁17㊁13㊁11及14个㊂2.5㊀TaTVP1蛋白三级结构域预测㊀根据前述预测的不同疏水氨基酸跨膜结构,进一步预测TaTVP1蛋白在细胞内形成的功能结构,分别利用不同长度的氨基酸序列进行模型匹配比较分析可知,全长TaTVP1氨基酸可折叠形成膜结构孔道蛋白高级结构(图5A),该孔道具有较清晰的管状结构;其中N 段300氨基酸(图5B)与C 端301~762aa(图5C)能够形成独立的孔道结构组成模型㊂2.6㊀TaTVP 1在小麦不同组织的表达分析㊀选用耐旱品种晋麦47和水地品种舜麦1718为材料,分析TaTVP 1基因在根㊁茎㊁叶㊁穗4个不同组织的表达水平,并比较该基因在2个品种中不同组织的表达水平㊂定量PCR 结果显示(图6),TaTVP 1在不同组织中的表达水平存在明显差异,在根与茎中的表达量较高,叶㊁穗组织中表达量较低㊂在2个品种间,晋麦47的茎中表达量最高,高出根中表达量的1.63倍,穗中表达量最低;而舜麦1718茎中TaTVP 1表达量与根中的表达量差异很小,叶㊁穗中的表达量较低㊂图3㊀TaTVP1跨膜结构分析Fig.3㊀Characteristics of transmembrane structure of TaTVP13㊀结论与讨论植物对逆境非生物胁迫的响应过程十分复杂,涉及生理㊁生化特性的多种过程㊂在植物中,H +转运无机焦磷酸酶与NHX 逆向转运蛋白可以稳定胞质内的酸碱度,使胞质内的Na +维持在较低浓度,进而增强植物的耐盐㊁耐旱性[15-16]㊂该研究中克隆所获得的小麦TVP 1基因的核苷酸序列与参考基因序列存在一些单核苷酸差异,这可能是不同品种小麦之间单核苷酸多态性造成的㊂而且,六倍体小麦中含有A㊁B㊁D3个染色体组,TVP 1在不同染色体组中还存有同源基因[17]㊂TaTVP1蛋白中12个跨膜区域中的疏水氨基酸序列具有较高的一致性,表明该蛋白在进化过程中,结构域遗传保守性较高,也预示着其在细胞中的功能不可替代㊂有研究报道,9851卷17期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀马燕斌等㊀小麦TaTVP 1基因的克隆与表达分析注:I~XII 为分析跨膜序列结果所标示的氨基酸序列,疏水性氨基酸有A 丙氨酸㊁Y 酪氨酸㊁F 苯丙氨酸㊁W 色氨酸㊁V 缬氨酸㊁I 异亮氨酸㊁L 亮氨酸和P 脯氨酸㊂Note:I -XII is the amino acid sequence marked by the analysis of transmembrane sequence results.Hydrophobic amino acids include A alanine,Y tyro-sine,F phenylalanine,W tryptophan,V valine,I isoleucine,L leucine and P proline.图4㊀TaTVP1的跨膜氨基酸保守序列Fig.4㊀Amino acid sequence of TaTVP1transmembrane注:A㊁B㊁C㊁D 分别表示氨基酸序列为全长㊁N 端1~300aa㊁C 端301~762aa 及241~762aa㊂Note:A,B,C and D represent the full length,N-terminal 1-300aa,C-terminal 301-762aa and 241-762aa respectively.图5㊀TaTVP1蛋白的3级结构分析Fig.5㊀Tertiary structure analysis of TaTVP1protein图6㊀TaTVP 1在小麦不同组织中的表达量Fig.6㊀Expression of TaTVP 1in different tissues of wheat9㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年拟南芥NHX肽链C末端的缺失可引起Na+/H+交换活性发生明显变化[18],表明C末端与Na+/H+交换活性密切相关,分析显示TVP1的C末端位于膜外的氨基酸序列较长,且亲水氨基酸含量较高,推测该序列可能参与胞质内的离子交换,影响Na+/H+的交换活性,同时,TVP1蛋白三级结构具有明显的孔道结构,也预示与其具有的质子泵作用密切相关,但具体的行使功能过程需要进一步探究㊂㊀㊀研究表明,植物耐盐性与耐旱性具有一定的相关性,耐旱材料往往也表现出较好的耐盐性㊂过表达液泡H+焦磷酸酶的转基因植物对高浓度NaCl的耐受性更强,对干旱的耐受性也更强,由此可知该基因有助于提高植株的耐旱和耐盐性[19-20]㊂而在各种非生物胁迫下,许多转H+焦磷酸酶基因植物的茎和根生物产量增加[21-24]㊂该研究组织特异性表达结果中,该基因在根㊁茎中的相对表达量明显高于叶㊁穗中,这可能与TVP1在不同组织中抗逆性的作用特征有关;耐旱品种晋麦47与舜麦1718相比,茎部表达量又明显高于根部,这种表达模式可能与晋麦47表现出优良的耐旱性特征相关,后续可以通过转化该基因等方法对其功能进行进一步阐释㊂该研究获得并分析了小麦TVP1基因的核苷酸与氨基酸序列,对其表达模式也进行了研究㊂后期将在小麦中过量表达TVP1基因,探究其耐旱㊁耐盐功能,并进一步阐释其机制,从而为培育耐逆优良种质的植物提供理论基础㊂参考文献[1]FLEURY D,JEFFERIES 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植物学通报 2005, 22 (3): 313￣319Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础研究发展规划项目(G1998010100)资助。②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zouqi@sdau.edu.cn收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-09-20 责任编辑: 孙冬花
研究论文小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性①
张 国 李 滨 邹 琦② (山东农业大学生命科学学院植物系 泰安 271018)摘要 Rubisco活化酶是广泛存在于光合生物中调节Rubisco活性的酶, 我们利用PCR技术, 从小麦(Triticum aestivum)叶片cDNA文库中克隆得到Rubisco活化酶基因cDNA片段, 该片段长度为850 bp, 编码201个氨基酸。Northern blot表明, 小麦叶片在暗诱导衰老的条件下, 叶片中活化酶基因表达水平逐渐下降; 同时, 小麦叶片的光合特性、叶绿素含量和Rubisco活性呈现下降趋势。这些结果表明, 衰老时小麦叶片Rubisco活化酶基因表达水平下降与光合速率下降密切相关。关键词 Rubisco活化酶, 小麦, 衰老
Cloning and Expression of Rubisco Activase Gene in WheatZHANG Guo LI Bin ZOU Qi②(Department of Botany, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018)Abstract Rubisco activase is an ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco inphotosynthetic autotrophs. A cDNA fragment of Rubisco activase gene was cloned fromwheat (Triticum aestivum). Northern blot showed that expression of the gene was down-regu-lated in dark-induced senescence leaves, where photosynthetic rate, chlorophyll content andRubisco activity also showed obvious decline. The results suggest that the decreased expres-sion level of the gene was related to the decline in photosynthetic rate.Key words Rubisco activase, Wheat, Senescence
Rubisco是光合生物进行光合碳同化关键的双功能酶, 它催化RuBP的羧化-加氧反应,但效率很低。因为加氧反应除了消耗能量,还损失了羧化反应中固定的25%的有机碳; 同时, 各种磷酸糖类能抑制Rubisco的活性, 如:底物RuBP本身就是Rubisco的强烈抑制剂, 且活化态Rubisco易于脱氨甲酰化而失活, 这些因素使Rubisco成为光合速率的限制因子, 因而也成为提高作物光合效率的研究目标。Salvucci等(1985)发现了Rubisco活化酶(Rubisco activase, RCA), 它能够活化Rubisco,同时具有ATPase活性; 也有人认为RCA是一种分子伴侣(Spreitzer and Salvucci, 2002)。植物中Rubisco的活化状态实际是Rubisco的失活速率和RCA活化Rubisco速率间的平衡状态(Crafts-Brandner and Salvucci, 2000)。人31422(3)们利用RCA抗体研究发现, RCA普遍存在于高等植物(包括C3和C4植物)、绿藻、部分蓝细菌和古细菌等光合生物中。衰老是植物发育过程中的一个阶段(Smart, 1994), 在衰老过程中最明显的一个变化是植物光合能力的下降(Correia et al., 1998)。高辉远研究大豆的生长发育后认为, 衰老时光合暗反应能力的衰退是光合能力衰退的决定因素①。对于小麦来说, 旗叶衰老时, 叶绿素下降包括缓降期和速降期, 而光合速率经历高值持续期后开始下降(张荣铣和程在全, 1992)。但小麦衰老时光合衰退与RCA的关系尚未见报道, 因此本文主要研究连续黑暗处理小麦叶片诱导衰老时, 小麦光合特性、Rubisco活性、叶绿素含量和RCA mRNA水平的变化规律, 探讨衰老时光合衰退的内在因素, 分析RCA在小麦叶片衰老期间的作用。1 材料与方法1.1 小麦叶片Rubisco活化酶基因片段的克隆参照构建小麦(Triticum aestivum)叶片cDNA文库所用pBK-CMV 噬菌粒载体序列,设计特异性引物T7: 5'-GTA ATA CGA CTCACT ATA GGG C-3'和T3: 5'-AAT TAACCC TCA CTA AAG GG-3', 筛选小麦叶片cDNA文库。1.2 净光合速率(Pn)、羧化效率(CE)和光化学效率(Fv/Fm)的测定小麦幼苗在自然光照条件下, 在Hoagland培养液中培养15天, 从第16天开始分成两组:对照组(CR)光照条件不变, 诱导组(DI)进行连续黑暗培养; 同时从第16天开始(包括第16天)每隔1天在上午8:30~9:30, 用CIRAS-1便携式光合系统(英国PP-Systems公司)测定完全伸展的第2片叶的Pn和CE; 用FMS2脉冲调制式荧光仪(Hansatech公司)测定叶片在自然光照下光系统Ⅱ的Fv/Fm; 之后取下完全伸展的第2片叶置液氮中冷冻, 保存于－80 ℃超低温冰箱, 用于提取叶绿素、小麦叶片总RNA和制备Rubisco粗提液, 试验过程共持续10天,取样6次。1.3 叶绿素含量的测定将取好的叶片置于冰冷的研钵中, 加入STN提取液(400 mmol.L－1蔗糖, 50 mmol.L－1pH7.2 Tris-HCl, 10 mmol.L－1 NaCl)约2 mL.g－1FW, 研磨成匀浆, 用网孔36 µm尼龙膜过滤, 滤液以5 500g离心5分钟, 沉淀用STN漂洗后再离心1次。沉淀(叶绿体)用20 mmol.L－1
pH7.5 HEPES (内含6 mmol.L－1 MgCl2)悬浮, 冰浴30分钟, 20 200g离心10分钟, 沉淀(类囊体)再用HEPES悬浮使叶绿素含量保持在0.8~2mg.L－1。取0.1 mL悬浮液加入4.9 mL 80%丙
酮摇匀, 5 000g离心2分钟, 用UV-120分光光度计(日本岛津)测定652 nm OD值: 叶绿素含量(mg.L－1)＝(A652×5)/(34.5×0.1)=A652×1.449 (Bugos et al., 1999)。1.4 Rubisco活性的测定Rubisco活性测定参见李立人等(1986)的14C同位素测定方法。将已取好的叶片定量
0.1 g, 加入1.9 mL预冷提取液[50mmol.L－1pH7.5 Tris-HCl, 1 mmol.L－1 EDTA, 10 mmol.L－1MgCl2, 12.5% (V/V) 甘油, 10 mmol.L－1 β-巯基乙醇, 1% PVP]和石英砂, 低温(4 ℃)研磨成匀浆, 15 000g离心10分钟, 上清液用于Rubisco活性测定(李卫芳等, 2001)。计算酶活力公式见括号内[基于鲜重的CO2量, µmol/(g・s) =Δdpm×V×10×1.5/(ξ×t×V'×60)]其中: Δdpm为样品dpm减去本底dpm, V为提取液总体积(µL), ξ为1.0 mol NaH14CO3的dpm,t为反应时间(s), V'为加入的酶液体积(µL)(翁晓燕等, 2001)。1.5 探针的制备和Northern杂交① 高辉远 (1999) 大豆生长发育过程中光合作用及光合
效率的调节. 博士学位论文, 山东农业大学, 泰安, 8-303152005张 国等: 小麦Rubisco 活化酶基因的克隆和表达特性用CTAB法提取小麦叶片总RNA, 1.2%甲醛变性凝胶电泳分离(溴化乙锭染色), RNA(20µg)在胶上分离后转移到尼龙膜。利用从小麦叶片cDNA文库得到的RCA基因片段, 设计引物5'-CCGTGATGGTCGTATGGAGA和5'-CAGCAAGAGATGGTGGGTGT, 利用PCR方法得到片段的3'端作为northern-blot探针的模板。利用α-[32P]dCTP标记纯化的50 ng的PCR产物。在42 ℃下将转移到尼龙膜的RNA与制备的探针预杂交12小时, 然后在42 ℃下杂交48小时, 洗膜后在－70 ℃放射自显影(Sambrook et al., 1989 ), 放射自显影的胶片使用GDS8000凝胶图像分析系统进行灰度扫描分析。2 结果2.1 小麦RCA的 cDNA 部分序列现在人们已经克隆了一些高等植物的RCA基因, 例如拟南芥(注册号为BT000613, 下同)、菠菜(J03610)、玉米(AY110044)、烟草(U35111)、棉花(AP329934)、水稻(U74321)和大麦(M55447) 等。我们从小麦叶片构成的cDNA文库中获得RCA基因的部分序列, 包含1 054 bp。 测序结果表明, 它的阅读框架有201个氨基酸序列, 与其他高等植物的RCA序列具有很高的同源性(图1), 其中与大麦、水稻、棉花和拟南芥的同源性分别为97%、84%、80%和78%。此片段已在GenBank注册, 注册号为AY602372。植物RCA(除了烟草和玉米等)一般都含a和b两种亚基, 正常条件下它们具活性, 但只有a亚基受硫氧还蛋白f(Trx-f)的调节, 原因是其C-末端具有2个Cys残基而b亚基没有, 这是Rubisco受光调节的最终原因(Zhang et al.,2002)。我们所获得的小麦RCA氨基酸序列C末端也具有对应于拟南芥的2个Cys残基(图1箭头所指), 这说明它是小麦RCA的a亚基氨基酸序列。2.2 小麦叶片暗诱导衰老过程中Pn、Fv/Fm、叶绿素含量、CE和Rubisco总活性的变化从图2的结果可以看出, 在10天的试验过程中, 对照组小麦光合速率和羧化效率略有上升; 而暗诱导衰老小麦随着诱导天数的增加,叶片逐渐变黄, 各种指标都下降, 但下降幅度和出现急剧下降的时间不同。暗诱导2天后,Rubisco总活性和羧化效率下降幅度比其他指标下降幅度大, Rubisco活性从第4天开始就急剧下降, 到第6天降到开始时活性的41%;羧化效率到第6天降到开始时的54%, 诱导8天后活性已很低, 基本不能进行羧化。第10天时Rubisco活性和羧化效率均接近于0。类囊体中叶绿素含量从诱导开始即持续减少, 但在整个诱导过程中, 减少趋势平缓, 几乎与时间成线性关系, 第6天时含量是开始的55%, 8天后叶片已完全变黄; 而光合速率在诱导开始时下降平缓, 6天后为速降期, 第10天净光合速率已接近于0。与碳同化的各项指标相反,反映PSⅡ功能的指标——PSⅡ最大Fv/Fm降低的十分缓慢, 开始几天几乎不变, 至6天后才显著降低。2.3 小麦叶片RCA基因在暗诱导叶片中的表达特性暗诱导小麦叶片不同时间后(图3), 对RCA的表达进行Northern 分析。结果表明,对照(D0)的RCA mRNA表达水平最高, 随着诱导时间的增长, RCA表达量( D1~D5)呈现出由高到低、逐渐减少的趋势, 诱导6天后表达量已经很低, 在8天时mRNA几乎已不存在。