第14章 分子发光分析法
分子发光分析法五种去活化过程
分子发光分析法五种去活化过程
一、表面活性剂洗涤
表面活性剂洗涤是一种常见的去活化过程，洗涤分子表面上的污染物，降低并去除和阻止分子表面上的污染物对发光特性的影响。
分子活性剂洗
涤试剂可以根据需要分类，包括非离子表面活性剂、离子表面活性剂和混
合表面活性剂。
通常情况下，洗涤剂应与活性剂结合，以提高洗涤效率，
同时具有良好的低温过程安全。
表面活性剂洗涤可以减少分子表面的污染物，从而改善样品的发光特性，如改善发射光谱，提高发射效率，并可能
改善分子检测的灵敏度。
二、抗化学处理
抗化学处理是指在特定条件下，通过在分子表面涂覆一层屏蔽膜，阻
止日常活动（如体积缩小，局部温度升高等）对分子表面造成的影响，从
而保持稳定性和发光性质。
抗化学处理可以在低温下进行，不改变分子组成，而且耐受性更好。
三、光致化学聚合
光致化学聚合是将分子用光进行处理，使用不同的光谱来影响分子的
特性，使其可以在恒定的环境中提供更稳定的发光性能。
四、气氛处理
气氛处理是指在恒定温度和压力的环境下，利用气体作用去活化分子
表面。
该过程可以去除表面污染物，改善发光特性，如改善发射光谱或提
高发射效率。
分子发光分析法
分子发光分析法某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。
化学发光（Chemiluminescence）又称为冷光（ColdLight），它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下，由化学反应而产生的光辐射。
化学发光分析（ChemiluminescenceAnalysis）就是利用化学反应所产生的发光现象进行分析的方法。
高灵敏度的痕量分析方法。
化学发光具有以下几个特点：1.极高的灵敏度：荧光虫素（LH2）（luciferin）、荧光素酶（luciferase）和磷酸三腺苷（ATP）的化学反应可测定2×10-17mol/L的ATP，可检测出一个细菌中的的ATP含量。
2.具有较好的选择性：由于可以利用的化学发光反应较少，而且化学发光的光谱是由受激分子或原子决定的，一般来说也是由化学反应决定的。
很少有不同的化学反应产生出同一种发光物质的情况，因此化学发光分析具有较好的选择性。
3．仪器装置比较简单：不需要复杂的分光和光强度测量装置，一般只需要干涉滤光片和光电倍增管即可进行光强度的测量。
4.分析速度快：一次分析在1min之内就可完成，适宜自动连续测定。
5.定量线性范围宽：化学发光反应的发光强度和反应物的浓度在几个数量级的范围内成良好的线性关系。
基本原理化学发光是基于化学反应所提供足够的能量，使其中一种产物的分子的电子被激发成激发态分子，当其返回基态时发射一定波长的光，称为化学发光，表示如下A+B→C﹡+DC﹡→C+hυ化学发光包括吸收化学能和发光两个过程。
为此，它应具备下述条件：1化学发光反应必须能提供足够的化学能，以引起电子激发。
2要有有利的化学反应历程，以使所产生的化学能用于不断地产生激发态分子。
3激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。
化学发光反应的化学发光效率ΦCl，取决于生成激发态产物分子的化学激发效率Φr利激发态分子的发光效率Φf这两个因素。
分子发光分析法课件
1.5 激发光谱和发射光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
A.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
B.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长( 选最大激发波长), 化 合物发射的荧光(或磷 光强度)与发射光波长 关系曲线(图中曲线II 或III)。
Chemiluminescence
2.1 概论
化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光 辐射。
优点：(1). 灵敏度很高。(2). 仪器设备简单，无须光源和 单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3). 线性范 围宽；(4). 分析速度快。
局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待 进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。
1.6 荧光(磷光)强度与溶液浓度的关系
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia ) 及
荧光量子产率(Фf）有如下关系
If = f Ia
由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可 推导出，当bc ≤0.05时，有：
If = 2.303 f I0 bc 与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷 光物质浓度之间的关系可表示如下：
剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的 刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在 所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易 制备和提纯。
B. 室温磷光分析
固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某 种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了 碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭 作用，显示室温磷光。
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
分子发光分析法与分子吸收
分子发光分析法与分子吸收
分子发光分析法是一种分析技术，它可以用来测定有机物质的含量。
它是一种非常灵敏的分析方法，可以用来测定微量物质的含量。
它的原理是，当一种特定的有机物质接触到一种特定的发光剂时，它会发出一种特定的发光，这种发光可以用来测定有机物质的含量。
分子发光分析法的优点是，它可以用来测定微量物质的含量，而且它的灵敏度很高，可以测定出微量物质的含量。
另外，它的操作简单，可以在实验室中进行，而且它的成本也比较低。
分子吸收分析法是一种分析技术，它可以用来测定有机物质的含量。
它的原理是，当一种特定的有机物质接触到一种特定的吸收剂时，它会吸收一种特定的波长的光，这种光可以用来测定有机物质的含量。
分子吸收分析法的优点是，它可以用来测定微量物质的含量，而且它的灵敏度很高，可以测定出微量物质的含量。
另外，它的操作简单，可以在实验室中进行，而且它的成本也比较低。
总之，分子发光分析法和分子吸收分析法都是一种非常有效的分析技术，它们可以用来测定有机物质的含量，而且它们的灵敏度很高，可以测定出微量物质的含量。
它们的操作简单，可以在实验室中进行，而且它们的成本也比较低，因此，它们在分析有机物质的含量方面非常有用。
分子发光
（ 3）基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基 态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
（4）激发三重态的能量较激发单重态的能量低。
2、分子能级结构与分子发射光谱
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射
跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫（VR）、内转化（ic）、体系间 窜跃（isc）等。
A
(2.3 A) 2 (2.3 A)3 I f I o [2.3 A ] 2 3
如果吸光度A<0.05, 方括号中其他各项与第一项相比 均可忽略:
I f 2.3 I o A
由于A=bc，故在实验条件固定时，荧光强度与浓
度成正比，即：
I f 2.3I 0 A
抗体、抗原
酶联免疫吸附分析示意 Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）
2. 荧光与有机化合物结构的关系
（1）跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历激发，然后经过
振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。
（2）共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光。 增加体系的共轭度荧光效率将增大，主要是由于增大荧 光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子。
类型 转入三重态猝灭： 溶解氧与荧光物质。 发生电子转移反应猝灭： 猝灭剂与荧光物质。 浓度较高单重激发态的分子在 荧光物质的自猝灭： 发生荧光之前和未激发的荧光 物质分子碰撞而引起的自猝灭。 29
二、荧光分析仪
Cary Eclipse 荧光分光光度计 荧光、磷光化学/生物发光 美国瓦里安技术中国有限公司
抗磁性。
当分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生电子自旋方
分子荧光分析法
大多数有机分子的基态处于单重态；
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
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2013-7-15
14.1.4 荧光光谱的特征
1.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比 激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 2. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样 ）成镜像对称关系。
3 2 1 0
S1
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3 2 1 0
S0
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2013-7-15
14.1.5 影响荧光强度的因素
1. 分子结构
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间窜越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
2013-7-15
荧光分析法的应用
(1)无机化合物
与有机试剂配合形成荧光配合物后测量；可测量约60多种元 素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；
色。
直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
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(3) 取代基效应
1）给电子取代基加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR 产生 p →π共轭 化合物
相对胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
蓝移:
△ E n →π*
＜
△ E n →π*
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几
（3）溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制，例
如苯胺；
2013-7-15
（4）荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与其他溶质分子之间相互作用，使荧光 强度减弱。引起荧光强度降低的物质-猝灭剂 碰撞猝灭（动态猝灭）：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰
F
0.11
0.29
0.46
0.60
0.52
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14.1.3 分子荧光光谱
荧光激发光谱与发射光谱
荧光(磷光)均为光致发光
MX hv i MX *
i 1
n
MX MX hv j
* j 1
n
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
C H
C
H
F=0.75
F=0.03
反式二苯乙烯 强荧光物质
顺式二苯乙烯 非荧光物质
电离效应对荧光发射的影响
OH O-
OH
O-
OHH+
OHH+
pH=1, 有荧光
2013-7-15
pH=13, 无荧光
无荧光
有荧光
(4) 结构刚性效应 荧光物质的刚性和平面
芴 联苯
性增加，有利于荧光发射。
F=1
F=0.2
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池 检测器 数据处理 仪器控制
荧光(磷光)分光光度计:
激发 单色器
光源
样品池
发射 单色器
检测器
2013-7-15
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
荧光分光光度计 样品池
It
It IF,p I0
I0
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14.3 分子荧光光谱法的应用
If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
浓度很低时，将括号项近似处理后：
If = 2.3 I0 l c = Kc
2013-7-15
（2）定量方法
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度；
撞，从而使荧光分子以无辐射形式跃迁回到基态；氧的熄灭
作用； 自猝灭：荧光物质浓度较大时，激发态分子与基态分子碰撞 。
2013-7-15
（5）内滤作用
内滤作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的
荧光，使得体系的荧光减弱。如色胺酸中的重铬酸钾。
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
S1
T1
S0
基态
S0
激发态单重态
S0
激发态三重态
分子电子激发态的多重性：M=2S+1; S为电子自旋量子数的 代数和(0或1)；大多数有机分子电子数偶数，基态：电子自旋 成对，是单重态；激发态：单重态、三重态；三重态能级比相 应单重态能级低（洪特规则）；
2013-7-15
荧光和磷光的产生；分子的去激发
特点
（1）灵敏度高
检测下限：0.1～0.001g/cm-3 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
缺点：应用范围小。
2013-7-15
定量依据与方法
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c )
2013-7-15
(1) 跃迁的类型
对于有机荧光物质:
n →π* εmax＜ 100 π→π* εmax≥104
π * →π
π* → n
平均寿命10-5~10-7sec 平均寿命10-7~10-9sec ; kS → T小
π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: ①具有大的共轭π键结构； ②具有刚性的平面结构；
2013-7-15
14.2 分子荧光光谱仪
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 光源：氙灯和高压汞灯， 或染料激光器(可见与紫外 区) 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 检测器：光电倍增管。 2013-7-15
振动弛豫
S2
内转换
反系间 窜跃
系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型 荧 磷 光：10-8 sec 光：10~10-3 sec
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
S1
２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 换:无辐射跃迁 回到基态
荧光 磷 光
内 转 换:S2~S1能级
之间有重叠 系间窜跃: S1~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S1
2013-7-15
-O
O C
O
N N
荧光素 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
2013-7-15
2. 环境因素
（1）溶剂的影响
无溶剂化作用 △ Eπ→π* ＞ 有溶剂化作用 △ Eπ→π*
在极性溶剂中：
红移:
（2）温度的影响
率增加；
analysis
relation between fluorescence and molecular structure
14.4 磷光光谱法 molecular phosphorescence
2013-7-15
第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家
N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝
铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
(2) 有机化合物
见表 2013-7-15
2013-7-15
2013-7-15
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：
14.4 磷光光谱法（理解）
通常借助于荧光和磷
光寿命的差别，采用 磷光镜的装置将荧光 隔开。
J
分子能级示意图
5 4 3 2 1
0
S2
5 4 3 2 1 T2
S1 2
1
0
0
5 4 3 2 1
0
T1
第一、第二 、…电子激发 单重态 S1 、 S2… ； 第一、第二 、…电子激发 三重态 T1 、 T2 … ；
S0 2013-7-15
5 4 3 2 1
0
单重态与三重态
受激有机分子的电子激发态可以归纳为两种状态：
2013-7-15
14.1 荧光和磷光的基本原理
14.1.1 分子荧光和磷光的产生