分子发光分析法
分子发光分析法五种去活化过程
分子发光分析法五种去活化过程
一、表面活性剂洗涤
表面活性剂洗涤是一种常见的去活化过程，洗涤分子表面上的污染物，降低并去除和阻止分子表面上的污染物对发光特性的影响。
分子活性剂洗
涤试剂可以根据需要分类，包括非离子表面活性剂、离子表面活性剂和混
合表面活性剂。
通常情况下，洗涤剂应与活性剂结合，以提高洗涤效率，
同时具有良好的低温过程安全。
表面活性剂洗涤可以减少分子表面的污染物，从而改善样品的发光特性，如改善发射光谱，提高发射效率，并可能
改善分子检测的灵敏度。
二、抗化学处理
抗化学处理是指在特定条件下，通过在分子表面涂覆一层屏蔽膜，阻
止日常活动（如体积缩小，局部温度升高等）对分子表面造成的影响，从
而保持稳定性和发光性质。
抗化学处理可以在低温下进行，不改变分子组成，而且耐受性更好。
三、光致化学聚合
光致化学聚合是将分子用光进行处理，使用不同的光谱来影响分子的
特性，使其可以在恒定的环境中提供更稳定的发光性能。
四、气氛处理
气氛处理是指在恒定温度和压力的环境下，利用气体作用去活化分子
表面。
该过程可以去除表面污染物，改善发光特性，如改善发射光谱或提
高发射效率。
分子发光分析法1
荧光分析法特点
• 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 • 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系。
五、定性分析
➢依据不同结构的物质所发射的荧光波长不 同可鉴别物质。
➢常用比较法 ➢激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高
定性结果的可信度
第三节 荧光分析仪器
➢19世纪前 肉眼观察 ➢1928年 Jette，West发明光电比色计 ➢1939年 应用光电倍增管（PMT） ➢1952年 商品化校正光谱仪器 ➢1980年后 计算机化
迁，如S2-S1；T2-T1。
• 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭”。
系间跨越
➢发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。
➢但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有 更大的发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
第六章分子发光分析法
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法和分子吸收分光光度法（MMS）是物理化学中测定物质含量和生物物质含
量的两种常用方法。
它们之间有共同点和不同之处，本文主要就这二者的原理和方法进行
介绍。
分子发光分析法（MALS）是用物质中的激发态分子把紫外线能量转换为可见光，用以表征
物质的测定方法。
该方法工作原理为紫外线照射激发态分子，激发态分子把紫外线能量转
变为可见光，然后通过光电器件检测发出的可见光，最终得出物质的测定结果。
MALS技术的优点在于检测结果准确，具有快速性，还可以检测生物样本中物质含量。
而分子吸收分光光度（MMS）是通过测量物质吸收入射光的程度，来表征物质的检测方法。
这种技术工作原理是将光源照射在样本上，样本中的物质会吸收一部分入射的紫外线，而
剩下的光经过反射和透射而到达检测器，最终通过计算获得物质的测定数值。
比较MMS和MALS，MMS技术具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，而且不受多种物质的干扰，也可以检测生物样本中的物质含量。
总之，MALS和MMS都是通过激发态分子转换紫外线能量为可见光，然后通过光电器件检测可见光，来判断物质的含量的两种常用技术，它们的优点和特点主要是MALS检测结果准确，具有快速性，而MMS则具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，也可以检测
生物样本中的物质含量。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
第二章分子发光分析
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
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只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动 能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l2′)。
（3） 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
2. 荧光强度与溶液浓度之间的关系 P128
荧光量子产率（）：是物质荧光特性的重要参数，它
反映了荧光物质发射荧光的能力，其数值越大，说明物质的
荧光能力越强。
发射的光量子数 吸收的光量子数
荧光强度（If）
吸收的光强收I
）
a
在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程， 如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光 的量子产率，与上述每一个过程的速率常数有关。如外转换 过程速度快，不出现荧光发射。
思考题：简述分子荧光光谱常与其吸收光谱呈镜像对称
关系, 而又不完全对称, 且荧光光谱的波长较长的理由。
[答](1)物质的吸收光谱是物质吸收光能后,由基态跃迁至 较高激发态的各个振动能级，产生吸收光谱的形状是由 激发态的能级分布决定的。 (2)分子荧光光谱是由基态的振动能级分布决定的。两者 情况相似,但又不相同,再加上物质分子在激发态和基态 受溶剂作用及环境的影响不同。
样）成镜像对称关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
小结：什么是分子荧光发射光谱与荧光激发光谱?
(1) 荧光激发光谱: 固定荧光发射波长, 扫描荧光激发波长, 所得到的激发波长与荧光强度的一维光谱曲线。
荧光发射光谱: 固定荧光激发波长, 扫描荧光发射波长, 所得到的发射波长与荧光强度的一维光谱曲线。 (2) 荧光发射光谱是供应能量使试样增加能量后，针对发 射的荧光所记录的光谱, 荧光激发光谱是以荧光为光源照射 试样后, 针对试样吸收能量所记录的光谱。
率，许多吸光物质不一定发荧光，就是由于他们 的吸光分子的荧光量子产率不高，而是将其吸收 的能量与溶剂分子或其他溶质分子的相互碰撞中 消耗掉了，因此不能发生荧光。
（1）共轭效应
实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物容易 发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅 少数高度共轭体系化合物除外）。任何有利于提高电子 共轭程度的结构的改变都将提高荧光效率，并使荧光波长 向长波方向移动。 共轭效应使荧光增强的原因 ：
T1、T2：第一 （二）电子激发 三重态
υ：基态和激发 态的振动能级
2. 无辐射跃迁
当激发态分子返回基态时，如果不伴有发光现象， 该过程称为无辐射去激或无辐射跃迁，该过程包括振 动弛豫（VR） 、内转换（IC）和系间窜跃（ISC）。
小结：分子荧光和磷光的产生
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-8～10 -6 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
1. 电子自旋状态的多重性
概 念 ： 单 重 态 （ S ） 、 基 态 （ S0 ） 、 第 一 激 发 单 重 态
（S1）、第二激发单重态（S2）、三重态（T）、第一激 发三重态（T1）、第二激发三重态（T2）
电子自旋状态的多重性
热能、电能、化学能或光能
S0：基态
S1、S2：第一 （二）电子激发 单重态
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0
l3
l1
l 2 l 2
二、分子荧光分析的基本原理
1. 激发光谱和发射光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
① 荧光(磷光)的激发光谱曲线 激发光谱反映了激发波长与荧光强度之间的关系，为荧 光分析选择最佳激发波长提供依据。 固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 。简而言之，固定发射波 长，找激发波长。
• 分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任 一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。
• 激发态分子从第一激发三重态 回到基态伴随的光辐射称为 磷光。
• 分子受化学能激发后产生的发光现象称为化学发光。
7-2 分子荧光分析法及其基本原理
一、分子荧光和磷光的产生
1. 电子自旋状态的多重性 分子荧光和磷光通常基于或n形式的 电子跃迁，因此都需要有不饱和官能团的存在。 在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不 同的自旋状态，常用电子自旋状态的多重性描述。