分子发光分析法
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分子发光分析法1
随的发光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配 对的 S=0 ，2S+1=1, 处于单重态，用S0表示。 • 磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。 电子在跃迁过程中伴随着自选方向的改变 S=1 2S+1=3，三重 态，用T表示。
荧光分析法特点
• 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 • 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系。
五、定性分析
➢依据不同结构的物质所发射的荧光波长不 同可鉴别物质。
➢常用比较法 ➢激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高
定性结果的可信度
第三节 荧光分析仪器
➢19世纪前 肉眼观察 ➢1928年 Jette，West发明光电比色计 ➢1939年 应用光电倍增管（PMT） ➢1952年 商品化校正光谱仪器 ➢1980年后 计算机化
迁，如S2-S1；T2-T1。
• 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭”。
系间跨越
➢发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。
➢但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有 更大的发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
荧光分析法特点
• 灵敏度高。检出限比分光光度法低2~4个数量级。 • 选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同
对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系。
五、定性分析
➢依据不同结构的物质所发射的荧光波长不 同可鉴别物质。
➢常用比较法 ➢激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高
定性结果的可信度
第三节 荧光分析仪器
➢19世纪前 肉眼观察 ➢1928年 Jette，West发明光电比色计 ➢1939年 应用光电倍增管（PMT） ➢1952年 商品化校正光谱仪器 ➢1980年后 计算机化
迁，如S2-S1；T2-T1。
• 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “猝灭”。
系间跨越
➢发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。
➢但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角
1、光源
• 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有 更大的发射强度；适用波长范围宽
• 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 • 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
利用汞蒸气放电发光的
光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线
分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
三章分子发光分析法
If = fIa= f ( Io-I )
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
(一)、荧光强度与浓度
将指数展开：
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与第一项相比均可忽略：
f I0
b
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
(二)、荧光熄灭
=
奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。
荧光分析的缺点——散射光影响
磷光分析的仪器
光源
检测器
贝克勒耳圆盘
低温磷光分析 固体基质室温磷光分析 保护流体室温磷光分析 无保护流体室温磷光分析
磷光分析的缺点——仪器复杂，需要固体基质或保护
化学发光分析的仪器
记录器
四 荧光、磷光和化学发光分析法 （Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）
化学发光效率φCL
化学发光效率等于激发态分子的产率φCe和激发态分子的发光效率φem之乘积.
化学发光的强度与反应物浓度间的关系
根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90％，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.
灵敏度和检出限
化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度. 一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（detection limit, DL）.
第六章分子发光分析法
ph（CH=CH）3ph 0.68 ph（CH=CH）2ph 0.28
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法与分子吸收分光光度
分子发光分析法和分子吸收分光光度法（MMS）是物理化学中测定物质含量和生物物质含
量的两种常用方法。
它们之间有共同点和不同之处，本文主要就这二者的原理和方法进行
介绍。
分子发光分析法（MALS）是用物质中的激发态分子把紫外线能量转换为可见光，用以表征
物质的测定方法。
该方法工作原理为紫外线照射激发态分子，激发态分子把紫外线能量转
变为可见光，然后通过光电器件检测发出的可见光，最终得出物质的测定结果。
MALS技术的优点在于检测结果准确，具有快速性，还可以检测生物样本中物质含量。
而分子吸收分光光度（MMS）是通过测量物质吸收入射光的程度，来表征物质的检测方法。
这种技术工作原理是将光源照射在样本上，样本中的物质会吸收一部分入射的紫外线，而
剩下的光经过反射和透射而到达检测器，最终通过计算获得物质的测定数值。
比较MMS和MALS，MMS技术具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，而且不受多种物质的干扰，也可以检测生物样本中的物质含量。
总之，MALS和MMS都是通过激发态分子转换紫外线能量为可见光，然后通过光电器件检测可见光，来判断物质的含量的两种常用技术，它们的优点和特点主要是MALS检测结果准确，具有快速性，而MMS则具有更高的灵敏度，可以进行更细小物质的检测，也可以检测
生物样本中的物质含量。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
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2)内转换( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振
动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可 在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2S1；T2-T1。
3)荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能层中的电子跃 迁至
基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：
第五章 分子发光分析法
(Molecular Luminescence Analysis)
要求
• 分子荧光是如何产生的？ • 具有哪种结构的分子可能具有较强的荧光？ • 荧光光谱仪与紫外-可见光谱仪有何不同？
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学 和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
干扰测量的因素较多。目前在生命科学中的应用使该方 法越来越重要。
二、基本原理
(一) 分子荧光的产生
单重态与三重态
单重态与三重态
Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相 反的自旋方向，即自旋配对。
单重态: 如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的， 大多数有机物分子的基态是处于单重态的。
3)激发光谱与发射光谱的关系 a 波长比较
与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产 生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致)
b 形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。不管激发波长如何，
电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的 各个振动能层。
c 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
去活化过程返回至基态。这些过程包括：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子
因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。
激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋 方向的变化，这时分子处于激发的单重态. 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s
三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变， 这时分
子便具有两个自旋不配对的电子，即s=1，分子的多重度，M=3，
分子处于激发的三重态。
第一节 荧光分析法 一、概述
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之 间。比UV-Vis的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 试样消耗量小、方法简便： 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
2
1
V=0
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
T2 三重态
T1
2
1
V=0
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转
换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨越跃迁后，
经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-410s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
S1 系间跨跃T1（高振动能层）振动弛豫T1（低振动能层）磷光发射S0
e
S2
去吸驰活收豫化演示
e
S1
S0
e
00:33:51
S0
e
去内荧活部光化转演换示
S2
e
S1
e e
S0
S0
00:33:51
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e
S1
e
e
S0
e
第二电子激发态
基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长 λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内
完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一
种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振 动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发， 有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧 光的机理。
第一电子激发态 基态
三重态
荧光 磷光
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
(三)荧光激发光谱与发射光谱
任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发 射光谱。它们是荧(磷)光定性、定量分析的基础。 1)激发光谱
改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的 强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者 完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激 发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最 适宜的激发波长。
性 质：三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上。
表 示：T1、
T2…：第一激发三重态和第二激发三重态等。
洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子， 平行自旋要比成 对自
旋更稳定，因此三重态能级能级<相应的单重态能级。
基态 ： S0 激发态： S1、S2… 振动能级：V=0，1，2，3…
2)发射光谱
发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐 照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对 其波长作图可得荧光发射光谱。
由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光 发射光谱可用于鉴别荧光物质。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可 在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2S1；T2-T1。
3)荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能层中的电子跃 迁至
基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：
第五章 分子发光分析法
(Molecular Luminescence Analysis)
要求
• 分子荧光是如何产生的？ • 具有哪种结构的分子可能具有较强的荧光？ • 荧光光谱仪与紫外-可见光谱仪有何不同？
分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学 和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回 至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
干扰测量的因素较多。目前在生命科学中的应用使该方 法越来越重要。
二、基本原理
(一) 分子荧光的产生
单重态与三重态
单重态与三重态
Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相 反的自旋方向，即自旋配对。
单重态: 如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的， 大多数有机物分子的基态是处于单重态的。
3)激发光谱与发射光谱的关系 a 波长比较
与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产 生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致)
b 形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。不管激发波长如何，
电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的 各个振动能层。
c 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
去活化过程返回至基态。这些过程包括：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子
因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。
激发的单重态：分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋 方向的变化，这时分子处于激发的单重态. 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s
三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变， 这时分
子便具有两个自旋不配对的电子，即s=1，分子的多重度，M=3，
分子处于激发的三重态。
第一节 荧光分析法 一、概述
分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性， 以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之 间。比UV-Vis的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 试样消耗量小、方法简便： 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
2
1
V=0
第二电子激发态S2 第一电子激发态S1
基态S0
T2 三重态
T1
2
1
V=0
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等
5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转
换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
6）磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨越跃迁后，
经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-410s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
S1 系间跨跃T1（高振动能层）振动弛豫T1（低振动能层）磷光发射S0
e
S2
去吸驰活收豫化演示
e
S1
S0
e
00:33:51
S0
e
去内荧活部光化转演换示
S2
e
S1
e e
S0
S0
00:33:51
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e
S1
e
e
S0
e
第二电子激发态
基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长 λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内
完成。
4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一
种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振 动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发， 有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧 光的机理。
第一电子激发态 基态
三重态
荧光 磷光
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
(三)荧光激发光谱与发射光谱
任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发 射光谱。它们是荧(磷)光定性、定量分析的基础。 1)激发光谱
改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的 强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者 完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激 发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最 适宜的激发波长。
性 质：三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上。
表 示：T1、
T2…：第一激发三重态和第二激发三重态等。
洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子， 平行自旋要比成 对自
旋更稳定，因此三重态能级能级<相应的单重态能级。
基态 ： S0 激发态： S1、S2… 振动能级：V=0，1，2，3…
2)发射光谱
发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐 照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对 其波长作图可得荧光发射光谱。
由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光 发射光谱可用于鉴别荧光物质。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱