仪器分析分子发光分析法优秀课件
合集下载
仪器分析分子发光分析法
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC VR T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
磷光
图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图
二、荧光、磷光与分子结构的关系
（一）荧光效率
• 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述
荧光量子效率
发荧光的分子数
f = 激发态分子总数
f 是一个物质荧光特性的重要参数， 反映了荧光物质发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间。
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
从S1的最低振动能级回到S0各振动能级所产 生的光辐射叫荧光
特点： • 产生速度快，10-9~10-6s； • 依赖于外部光源 • 荧>激
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
浓度
C1
荧光强度 If1
C2 C3 If2 If3
C4 C5 Cx If If4 If5 Ifx Ifx
Cx
C
2. 荧光猝灭法
• 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵 敏度和选择性
• 荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基 态配合物MQ
M + Q = MQ（非荧光物质）
Kf
C(MQ) C(M )C(Q)
• -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子 基团
• 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云 与苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电 子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧 光强度增强
第5章分子发光分析法PPT课件
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
内转换：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第
一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频
率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激
发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
样）成镜像对称关系。
22.11.2020
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
22.11.2020
三、荧光的产生与分子结构的关系
（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。
系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通
过自旋—轨道耦合等作用完成系间跨越。
22.11.2020
（2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
分子发光分析ppt课件
仪器分析
光谱分析
原子光谱
原子吸收 原子发射 原子荧光
分子吸收 分子光谱
分子发光
紫外-可见光谱 红外光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子 吸收能量 激发为激发态 释放出能量 基态
电能 化学能 光能
分子发光
光致发光 化学发光
辐射跃迁 非辐射跃迁
光的形式释放 以热的形式释放
称为“发光”
荧光 磷光
3
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A)
I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入 上式得
If = I0(1- 10 -kb c)
28
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为：
特殊化学作用如氢键的生成
同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同
因素
温度
内部能量转化作用增大 碰撞频率增加，使外转换的几率增加
温度上升使荧光强度下降
化合物所处状态不同
酸度 电子构型上有所不同
荧光强度和荧光光谱不同
30
31
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
敏化磷光：
通过能量转移产生磷光
42
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
光谱分析
原子光谱
原子吸收 原子发射 原子荧光
分子吸收 分子光谱
分子发光
紫外-可见光谱 红外光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子 吸收能量 激发为激发态 释放出能量 基态
电能 化学能 光能
分子发光
光致发光 化学发光
辐射跃迁 非辐射跃迁
光的形式释放 以热的形式释放
称为“发光”
荧光 磷光
3
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
A=-lg I/ I0 I= I0 .10- A Ia = I0 - I = I0(1- 10 -A)
I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入 上式得
If = I0(1- 10 -kb c)
28
整理得：
If =2.3 I0 kbc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为：
特殊化学作用如氢键的生成
同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同
因素
温度
内部能量转化作用增大 碰撞频率增加，使外转换的几率增加
温度上升使荧光强度下降
化合物所处状态不同
酸度 电子构型上有所不同
荧光强度和荧光光谱不同
30
31
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
敏化磷光：
通过能量转移产生磷光
42
磷光分析仪器
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。 在有荧光发射的同时测量磷光
第十六章分子发光分析法-PPT精品
2019/10/30
2.化学发光效率
发射光子的分子数
cl 参 加 反 应 的 分子 ce数e m
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
Iclt
cl
dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
2019/10/30
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这 一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2. 仪器设备简单
不需要光源、单色器和背景校正；
3. 发射光强度测量无干扰
无背景光、散射光等干扰；
4. 线性范围宽 5. 分析速度快
缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生 物体中的发光）；机理研究少。
2019/10/30
2019/10/30
2019/10/30
三、装置与技术
instrument and technology
NADH脱氢酶
NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2
黄素酶
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h 最大发射波长495 nm；
2019/10/30
2.化学发光效率
发射光子的分子数
cl 参 加 反 应 的 分子 ce数e m
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
Iclt
cl
dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
2019/10/30
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这 一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2. 仪器设备简单
不需要光源、单色器和背景校正；
3. 发射光强度测量无干扰
无背景光、散射光等干扰；
4. 线性范围宽 5. 分析速度快
缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生 物体中的发光）；机理研究少。
2019/10/30
2019/10/30
2019/10/30
三、装置与技术
instrument and technology
NADH脱氢酶
NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2
黄素酶
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h 最大发射波长495 nm；
2019/10/30
第五章分子发光分析法讲义
⑵、内转换（ic）
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
指相同多重态的两个电子态之间（S2 S1，S1 S0） 的非辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能 级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转 移至低能级。如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层 相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动 驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
例: 区别谱图中的 三个峰，说明判断
原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
⑴、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的 结构，才能吸收激发光；
⑵、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）
2、荧光效率 ⑴、荧光效率
发荧光的分子数
f 激发态分子总数
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence） 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活
化过程的一种形式是以10-9~10-6s左右的短时间发射一 个光子返回基态。这一过程称为荧光发射。 （单重— 单重，停10-9——10-6s ）
2
S2 1
V=0
2
S1 1
V=0
VR
ic
F
S0
3 2
1
V=0
λ1 λ2 λ3
isc
2 1
T1
V=0
VR
P
ic
isc
F P
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
1、激发光谱：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择 合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定
以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变 激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为 横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
仪器分析分子发光分析法课件
第七章 分子发光分析法
分子发光：
M + 能量
光致发光：
M + hv
M*
M + hv
M*
M + hv'
第七章 分子发光分析法
第一节 分子荧光、磷光产生基本原理 第二节 荧光光谱与基本特征 第三节 荧光产率与分子结构的关系 第四节 影响荧光强度的环境因素 第五节 分子发光光谱仪结构流程 第六节 定量分析方法
共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向 移动。
化合物
苯 萘 蒽 丁省
量子产率φF 0.11 0.29 0.46 0.60
λex（nm） 205 286 365 390
λem（nm） 278 321 400 480
第三节 荧光产率与分子结构的关系
（三）、 刚性平面结构 1. 减少分子振动，减小外转换。 2. 增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。
第一节 分子荧光磷光产生基本原理
(一)、非辐射跃迁
1. 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由 高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动 弛豫的时间10 -12 s。
S2
hv
S0
e
第一节 分子荧光磷光产生基本原理 2. 内转换：相同多重度的电子能级中, 相等能级间的 非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
第一节 分子荧光磷光产生基本原理
(二)、辐射跃迁
1. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能 级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。
S2
S1
T1
hv
hv′
S0 e
分子发光：
M + 能量
光致发光：
M + hv
M*
M + hv
M*
M + hv'
第七章 分子发光分析法
第一节 分子荧光、磷光产生基本原理 第二节 荧光光谱与基本特征 第三节 荧光产率与分子结构的关系 第四节 影响荧光强度的环境因素 第五节 分子发光光谱仪结构流程 第六节 定量分析方法
共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向 移动。
化合物
苯 萘 蒽 丁省
量子产率φF 0.11 0.29 0.46 0.60
λex（nm） 205 286 365 390
λem（nm） 278 321 400 480
第三节 荧光产率与分子结构的关系
（三）、 刚性平面结构 1. 减少分子振动，减小外转换。 2. 增大分子吸光截面，增大摩尔吸光系数。
第一节 分子荧光磷光产生基本原理
(一)、非辐射跃迁
1. 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由 高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动 弛豫的时间10 -12 s。
S2
hv
S0
e
第一节 分子荧光磷光产生基本原理 2. 内转换：相同多重度的电子能级中, 相等能级间的 非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
第一节 分子荧光磷光产生基本原理
(二)、辐射跃迁
1. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能 级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。
S2
S1
T1
hv
hv′
S0 e
《分子发光分析法》PPT课件
F
0.11 0.29
λexmax(nm) 205 286
λemmax (nm) 278 321
蒽
丁省
0.46
0.60
365
390
400
480
精选课件ppt
7-2
戊省 0.52 580 640
提要 返20 回
3.荧光与分子结构的关系
• 2）刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，
有利于荧光发射。
精选课件ppt
3. 荧光和磷光光谱的产生
（1）荧光：
S1或T1 发光 S0
当电子从第一激发单重态S1的最低振动 能级回到基态S0各振动能级所产生的光 辐射叫荧光
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生 速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬 时荧光，外部光源停止照射，荧光马上 猝灭
精选课件ppt
7-2 提要 返10 回
精选课件ppt
提要 返3 回
7-2 分子荧光分析法及其原理
• 一、分子荧光和磷光的产生
1.电子自旋状态的多重性
2. 无辐射跃迁
3. 荧光和磷光光谱的产生
二、分子荧光分析法的基本原理
1.激发光谱和荧光谱
2.荧光强度及其与浓度的关系
3.荧光与分子结构的关系
4.影响荧光强度的因素
精选课件ppt
提要 返4 回
一、荧光和磷光光谱的产生(图)
• 具有不饱和基团的基态分子光照后，价 电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子
光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
精选课件ppt
7-2
提要 返5 回
1. 电子自旋状态的多重性
• 单重态：用 “S0” 表示 • 当物质受光照射时，基态电子能级跃迁至
分子发光分析法概况课件
分子发光分析法的优缺点
优点
高灵敏度
分子发光分析法通常具 有很高的灵敏度，能够 检测出低浓度的目标物
。
选择性
某些发光分子可以与目 标物发生特异性反应， 从而提高分析的选择性
。
操作简便
分子发光分析法通常操 作简单，所需仪器设备 相对简单，便于现场快
速检测。
缺点
背景干扰
发光分析法容易受到环 境背景光的影响，如日 光、荧光等，导致检测
01
02
研发能够延长发光分子寿命 的技术，以减少检测过程中
的误差和不确定性。
03
04
克服背景干扰
研究和发展能够有效排除背 景光干扰的技术和方法，以 提高检测的稳定性和准确性
。
拓展应用领域
进一步探索发光分析法在环 境监测、生物医药、食品安 全等领域的应用，以满足更
广泛的需求。
06 结论
总结分子发光分析法的概况与重要性
结果不稳定。
发光衰减
某些发光分子的发光强 度会随时间衰减，影响 检测的准确性和稳定性
。
成本较高
某些高灵敏度的发光分 子和仪器设备成本较高 ，限制了其在某些领域
的应用。
未来发展方向与挑战
提高灵敏度和选择性
延长发光寿命
进一步研发具有更高灵敏度 和选择性的发光分子，以满 足更低检测限和更高准确性
的需求。
新型的分子发光分析方法和技术不断 涌现，如荧光免疫分析、荧光偏振免 疫分析、时间分辨荧光免疫分析等。
02
分子发光分析法的基本原理
分子发光的过程与机制
01
分子发光是指分子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再由激 发态回到基态时释放光子的过程。
02
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
仪器分析分子发光分析法优秀 课件
§ 5- 1 分子发光分析法及其分类
• 分子发光分析法
较高激发态
吸收能量 受激
退激 光辐射
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理 不同分为以下几类： 光致发光：以光能来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图
（2）磷光
• S1 体系间窜跃(isc) T1 发光
S0 磷光
• 特点：
• 发光速度慢，约为 10-4 ~ 10s，
• 光照停止后，磷光仍可持续一段时间
磷光的波长更长 磷 > 荧> 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
温度对磷光影响更大
3. pH的影响
• 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物 的荧光性质受溶液pH的影响很大
• 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体， 具有各自的荧光效率和荧光波长
例： 苯酚
_
OH
O
_
OH
H+
离子化后， 荧光消失
pH≈1有 荧光
pH≈13 无荧光
• 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
• 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程
• 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
•分析上有应用价值的荧光化合物的荧光 效率大于0.1。
（二）荧光磷光与有机化合物结构的 关系
• 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定 量地描述荧光与分子结构之间的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、 n *跃迁，产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数 大102~103，寿命短
（3）影响不明显的取代基
-NH3+、-R、- SO3H等
三、环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响
不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质 溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
因为辐射跃迁的速率基本不随温度变; 非辐射跃 迁随温度升高显著增大。
荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。
§ 5- 2 荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生
• 基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子 光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
• 分子中的电子数及自旋方向
第一激发单重态 S1
基态单重态 S0 S0, S1, S2, S3分别代表基态、第一、 二、 三激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8
• -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子 基团
• 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云 与苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电 子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧 光强度增强
COOR 、-NO、-SH 吸电子 基团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应 为重原子效应。
光分析法
热致发光 、生物发光、电致发光
荧 光
激发光谱和荧光光谱
强
度
I
λex,max
λfl,max
300
400
500
硫酸奎宁的两个光谱
λ 波长（nm)
硒 油类 石油烃
荧光分光光度法 GB17378.5-1998(13.1) 沉积物 荧光分光光度法 GB17378.5-1998(14.1)
荧光分光光度法 GB17378.6-1998(14.1)
• *跃迁常产生较强的荧光， n *跃 迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产 生更强的磷光
1. 共轭体系——有较强的荧光
• 具有共轭体系的芳环或杂环化合物, 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环 越多，共轭程度越大, 产生荧光波长越 长，发射的荧光强度越强
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
-o
o
o
-o
o
coo -
荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平 面上，具有平面结 构，强荧光物质
coo -
酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很 好的共平面，为非 荧光物质
例 1，2 - 二苯乙烯
H
H
C=C
H C=C H
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
（三）取代基的类型
• （1）增强荧光的取代基
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
从S1的最低振动能级回到S0各振动能级所产 生的光辐射叫荧光
特点： • 产生速度快，10-9~10-6s； • 依赖于外部光源 • 荧>激
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可 用荧光法测定 • 3,4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
第一激发三重态 T1 基态单重态 S0
自旋平行
T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态
由基态单重态→激发三重态，净自旋 0。这 种跃迁为禁阻跃迁
三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命 约为10-4 ~ 1S
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC VR T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
磷光
图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图
二、荧光、磷光与分子结构的关系
（一）荧光效率
• 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述
荧光量子效率
发荧光的分子数
f = 激发态分子总数
f 是一个物质荧光特性的重要参数， 反映了荧光物质发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间。
§ 5- 1 分子发光分析法及其分类
• 分子发光分析法
较高激发态
吸收能量 受激
退激 光辐射
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理 不同分为以下几类： 光致发光：以光能来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图
（2）磷光
• S1 体系间窜跃(isc) T1 发光
S0 磷光
• 特点：
• 发光速度慢，约为 10-4 ~ 10s，
• 光照停止后，磷光仍可持续一段时间
磷光的波长更长 磷 > 荧> 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
温度对磷光影响更大
3. pH的影响
• 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物 的荧光性质受溶液pH的影响很大
• 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体， 具有各自的荧光效率和荧光波长
例： 苯酚
_
OH
O
_
OH
H+
离子化后， 荧光消失
pH≈1有 荧光
pH≈13 无荧光
• 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
• 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程
• 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T
发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
•分析上有应用价值的荧光化合物的荧光 效率大于0.1。
（二）荧光磷光与有机化合物结构的 关系
• 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定 量地描述荧光与分子结构之间的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、 n *跃迁，产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数 大102~103，寿命短
（3）影响不明显的取代基
-NH3+、-R、- SO3H等
三、环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响
不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质 溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
因为辐射跃迁的速率基本不随温度变; 非辐射跃 迁随温度升高显著增大。
荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。
§ 5- 2 荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生
• 基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子 光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
1. 电子自旋状态的多重性
• 分子中的电子数及自旋方向
第一激发单重态 S1
基态单重态 S0 S0, S1, S2, S3分别代表基态、第一、 二、 三激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8
• -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子 基团
• 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云 与苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电 子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧 光强度增强
COOR 、-NO、-SH 吸电子 基团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应 为重原子效应。
光分析法
热致发光 、生物发光、电致发光
荧 光
激发光谱和荧光光谱
强
度
I
λex,max
λfl,max
300
400
500
硫酸奎宁的两个光谱
λ 波长（nm)
硒 油类 石油烃
荧光分光光度法 GB17378.5-1998(13.1) 沉积物 荧光分光光度法 GB17378.5-1998(14.1)
荧光分光光度法 GB17378.6-1998(14.1)
• *跃迁常产生较强的荧光， n *跃 迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产 生更强的磷光
1. 共轭体系——有较强的荧光
• 具有共轭体系的芳环或杂环化合物, 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环 越多，共轭程度越大, 产生荧光波长越 长，发射的荧光强度越强
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
-o
o
o
-o
o
coo -
荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平 面上，具有平面结 构，强荧光物质
coo -
酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很 好的共平面，为非 荧光物质
例 1，2 - 二苯乙烯
H
H
C=C
H C=C H
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
（三）取代基的类型
• （1）增强荧光的取代基
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
从S1的最低振动能级回到S0各振动能级所产 生的光辐射叫荧光
特点： • 产生速度快，10-9~10-6s； • 依赖于外部光源 • 荧>激
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可 用荧光法测定 • 3,4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
第一激发三重态 T1 基态单重态 S0
自旋平行
T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态
由基态单重态→激发三重态，净自旋 0。这 种跃迁为禁阻跃迁
三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命 约为10-4 ~ 1S
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失
VR S2
IC VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC VR T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
磷光
图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图
二、荧光、磷光与分子结构的关系
（一）荧光效率
• 荧光强度常用荧光量子效率φf 来描述
荧光量子效率
发荧光的分子数
f = 激发态分子总数
f 是一个物质荧光特性的重要参数， 反映了荧光物质发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间。