分子发光分析法
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分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
第六章分子发光分析法
ph（CH=CH）3ph 0.68 ph（CH=CH）2ph 0.28
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
化合物 苯 萘
蒽
f 0.11 0.29
0.46
丁省
0.60
戊省
0.52
• 3）刚性结构：
• 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
• 原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其 它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能 性。
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0 l1
l2
l 2
l3
分子内的光物理过程
1.2 激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
第一节 分子发光的基本原理
• 一、 分子荧光及磷光光谱的产生 • 1.1荧光及磷光的产生
电
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、荧光与分子结构的关系
• 1 荧光量子产率
• 分子产生荧光必须具备的条件：
• i） 分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；
• ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。
• 即荧光量子产率（荧光效率或量子效率） 足够大.
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
第二章分子发光分析
18
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
分子发光分析
荧光强度和荧光光谱不同
26
27
3、荧光猝灭
定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子
的相互作用引起荧光强度降低的现象 碰撞猝灭荧激光发分单子重以态无的辐荧射光跃分迁子的与方猝式灭回剂到分基子态相碰撞
静态猝灭 荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光
的络合物
类型 转入三重态的猝灭 溶解氧与荧光物质 发生电子转移反应的猝灭 猝灭剂与荧光物质
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型
实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
1．如何获得较强的磷光
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级
→基态， T1 → S0跃迁；
电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
增加试样的刚性:
低温冷冻
固体磷光法：
吸附于固相载体（滤纸）
分子缔合物的形成：
加入表面活性剂等
重原子效应：
加入含重原子的物质，如银盐等
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单击此处编辑母版文本样式本章内容 3.0 引言 3. 1 基本原理 3.1.1 荧光及磷光的产生
3.1.2 荧光物质的激发光谱与发射光谱 3.1.3 荧光与分子结构的关系 3.1.4 溶液的荧光强度 3. 2 分子荧光分析仪器 3. 3 分子荧光分析法及其应用
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Henan University of Technology
单2.荧击光此分处析编的辑特母点版：文本样式
为什么？
灵敏度高：比UV-Vis的灵敏度高得多（2-4个数量级）！
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。
结构信息量多：激发光谱、发射光谱、光强、
荧光量子效率、荧光寿命等。
应用不广泛：能发荧光的物质少、
增强荧光的方Henan University of Technology
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2
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单3.0击引此言处编辑母版文本样式
光学分析法
光谱法
非
光
原子光谱法
分子光谱法
谱
法
原
原
紫 红分
子
子
外 外子
吸
发
可 光发
收
射
见 谱光
光
光
分 法分
谱
谱
光
析
法
法
光
度
法
3
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振动驰豫 内转换
外转换 系间跨越
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单1）击振此动处弛编豫辑（母V版ib文rat本ion样al式Relaxation, VR）
在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰 撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从Sn高振动能 层失活至该电子能级最低振动能层的过程，称为振动弛豫。
T2 S1
T1
基态S0
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单3）击外此转处换编（辑E母xte版rn文al 本Co样nv式ersion，EC）
受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换,而使
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单2. 去击活此化处过编程辑（母D版e文ac本tiv样ati式on）
过程：激发态分子→辐射或非辐射跃迁等→基态
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃
迁方式等再回到基态。
去活化
发射光子
非辐射跃迁 化学反应
荧光
磷光
S1 三重态
T1
基态S0
l 1 λ1
l 2 λ2
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单2）击内此转处换编（辑In母te版rna文l C本o样nv式ersion，IC）
当两个电子能级非常靠近,以致其振动能级有重叠时，
发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，
高振动能级 → 低振动能级
发生振动弛豫的时间：10-12s
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3. 1 基本原理 单击此处编辑母版文本样式
设处于基态单H重en态an 中Un的ive电rsit子y o吸f Te收ch波nol长ogy为
λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二 单重态S2及第一单重态S1。
第二电子激发态
S2 振动弛豫
第一电子激发态
单• 基击态此(处S0)编: 室辑温母下版，文分本子样处式于基态的振的动自能旋方级向。，即自旋配对。 此时所有电子皆遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特 规则。
• 激发态: 被激发后, 能量变高, 属非稳状态。
单重态（S） 三重态（T）
洪特规则：处于分立轨道上的非成 对电子，平行自旋要比成对自旋更 稳定。
相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁
【例】:高电子能能级→→低电子能级
S2 →→ S1 T2 →→ T1 发生内转换的时间： 10-13 ～10-11s
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3. 1 基本原理 单击此处编辑母版文本样式
第二电子激发态
S2
第一电子激发态
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三线态
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Instrumental Analysis Chapter 3
分子发光分析法 Molecular Luminescence-Fluorescence
河南工业大学化学化工系分析测试中心 范璐
1
单击此处编辑母版文本样式本章内容 3.0 引言 3. 1 基本原理 3. 2 分子荧光分析仪器 3. 3 分子荧光分析法及其应用
3. 1 基本原理 单3.击1.此1 处荧编光辑及母磷版光文的本产样生式 分子具有一系列严格分立的能级—电子能级
每个电子能级中又含有一系列振动能层和转动能层
电
子
能 级
转 动
能
级
振 动 能
分子中电子能级、
级
振动能级和转动能级示意图
7
PaulHie不na相n U容n原ive理rsi：ty o分f T子ec中hn同olo一gy轨 道所占据的两个电子必须具有相反
单去击活此过处程编：辑从母激版发文单本重样态式（S1、S2）或激发三重态（T1）回到 基态（ S0 ） 非辐射过程＋发射光子的过程
分 子 发 光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返 回至基态并发射出光子，此种现象称为分子发光。
荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的 特殊性，会发出比吸收波长更长的光，当紫外光 停止照射时, 随之消失的光叫做荧光，不立即消 失的光叫磷光。
第二电子激发态S2
第一电子激发态S1
单重态：如果分子中全部轨道里的 电三子重都态是：自如旋果配电对子的在，跃即迁过s=程0,中分还 子伴具的随有多着两重自个度旋自方旋=1向不, 的配该改对分变的子，电体这子系时处分于子单 重态
基态S0
T2 T1 三重态
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Henan University of Technology
单1.分击子此发处光编的辑类母型版文本样式 按激发的模式分类： 分子发光
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
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3.1.2 荧光物质的激发光谱与发射光谱 3.1.3 荧光与分子结构的关系 3.1.4 溶液的荧光强度 3. 2 分子荧光分析仪器 3. 3 分子荧光分析法及其应用
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单2.荧击光此分处析编的辑特母点版：文本样式
为什么？
灵敏度高：比UV-Vis的灵敏度高得多（2-4个数量级）！
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。
结构信息量多：激发光谱、发射光谱、光强、
荧光量子效率、荧光寿命等。
应用不广泛：能发荧光的物质少、
增强荧光的方Henan University of Technology
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单3.0击引此言处编辑母版文本样式
光学分析法
光谱法
非
光
原子光谱法
分子光谱法
谱
法
原
原
紫 红分
子
子
外 外子
吸
发
可 光发
收
射
见 谱光
光
光
分 法分
谱
谱
光
析
法
法
光
度
法
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Henan University of Technology
振动驰豫 内转换
外转换 系间跨越
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单1）击振此动处弛编豫辑（母V版ib文rat本ion样al式Relaxation, VR）
在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰 撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从Sn高振动能 层失活至该电子能级最低振动能层的过程，称为振动弛豫。
T2 S1
T1
基态S0
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单3）击外此转处换编（辑E母xte版rn文al 本Co样nv式ersion，EC）
受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换,而使
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3. 1 基本原理
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单2. 去击活此化处过编程辑（母D版e文ac本tiv样ati式on）
过程：激发态分子→辐射或非辐射跃迁等→基态
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃
迁方式等再回到基态。
去活化
发射光子
非辐射跃迁 化学反应
荧光
磷光
S1 三重态
T1
基态S0
l 1 λ1
l 2 λ2
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3. 1 基本原理
Henan University of Technology
单2）击内此转处换编（辑In母te版rna文l C本o样nv式ersion，IC）
当两个电子能级非常靠近,以致其振动能级有重叠时，
发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，
高振动能级 → 低振动能级
发生振动弛豫的时间：10-12s
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3. 1 基本原理 单击此处编辑母版文本样式
设处于基态单H重en态an 中Un的ive电rsit子y o吸f Te收ch波nol长ogy为
λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二 单重态S2及第一单重态S1。
第二电子激发态
S2 振动弛豫
第一电子激发态
单• 基击态此(处S0)编: 室辑温母下版，文分本子样处式于基态的振的动自能旋方级向。，即自旋配对。 此时所有电子皆遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特 规则。
• 激发态: 被激发后, 能量变高, 属非稳状态。
单重态（S） 三重态（T）
洪特规则：处于分立轨道上的非成 对电子，平行自旋要比成对自旋更 稳定。
相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁
【例】:高电子能能级→→低电子能级
S2 →→ S1 T2 →→ T1 发生内转换的时间： 10-13 ～10-11s
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3. 1 基本原理 单击此处编辑母版文本样式
第二电子激发态
S2
第一电子激发态
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三线态
单击此处编辑母版文本样式
Henan University of Technology
Instrumental Analysis Chapter 3
分子发光分析法 Molecular Luminescence-Fluorescence
河南工业大学化学化工系分析测试中心 范璐
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单击此处编辑母版文本样式本章内容 3.0 引言 3. 1 基本原理 3. 2 分子荧光分析仪器 3. 3 分子荧光分析法及其应用
3. 1 基本原理 单3.击1.此1 处荧编光辑及母磷版光文的本产样生式 分子具有一系列严格分立的能级—电子能级
每个电子能级中又含有一系列振动能层和转动能层
电
子
能 级
转 动
能
级
振 动 能
分子中电子能级、
级
振动能级和转动能级示意图
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PaulHie不na相n U容n原ive理rsi：ty o分f T子ec中hn同olo一gy轨 道所占据的两个电子必须具有相反
单去击活此过处程编：辑从母激版发文单本重样态式（S1、S2）或激发三重态（T1）回到 基态（ S0 ） 非辐射过程＋发射光子的过程
分 子 发 光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返 回至基态并发射出光子，此种现象称为分子发光。
荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的 特殊性，会发出比吸收波长更长的光，当紫外光 停止照射时, 随之消失的光叫做荧光，不立即消 失的光叫磷光。
第二电子激发态S2
第一电子激发态S1
单重态：如果分子中全部轨道里的 电三子重都态是：自如旋果配电对子的在，跃即迁过s=程0,中分还 子伴具的随有多着两重自个度旋自方旋=1向不, 的配该改对分变的子，电体这子系时处分于子单 重态
基态S0
T2 T1 三重态
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单1.分击子此发处光编的辑类母型版文本样式 按激发的模式分类： 分子发光
光致发光 化学发光 生物发光
荧光 磷光
按光子能量分类： 荧光
斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem 反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem 共振荧光(Resonance)：λex=λem
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