转基因动植物生物反应器 综述
09转基因动物与生物反应器-HXY78页PPT
转基因动物技术路线
外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系
哺乳动物生殖生理
哺乳动物受精和妊娠，整乳动物的制备方法
显微注射法 逆转录病毒载体感染 胚胎干细胞介导法 精子载体介导法 YAC介导的基因转移
1 显微注射法
雄性原核
显
受精卵
微
注
射
显微注射
法
操
作
胚胎移植
流
程
后定检测
显微注射法的优点
a、转移率较高、整合效率达30%； b、外源基因长度可达50Kb； c、方法简单，导入过程直观；
缺点
a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、常造成插入位点附近宿主DNA大片
段缺失、重组等突变，出现动物严重 生理缺陷； d、外源基因能否稳定整合要到子一代 中筛选得到。
1987年美国科学家戈登（Gordon）等 人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋 白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）， 展示了用动物乳腺生产高附加值产品的 可能性。利用动物乳腺生产高价值产品 的方式称为乳腺生物反应器。
微生物反应器 植物反应器 动物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
疾病模型
基因转移方法
转导的基因
转基因生物反应器
反转录病毒感染法：将含目的基因的反转录病毒载体人为感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生转基因动物。
01
特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。
02
但不能完全杜绝反转录病毒在转基因动物生产的商品中的污染。
03
卵母细胞显微注射法 基本方法：将带有外源目的基因的反转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精，胚胎移植获得转基因动物。 优点（ห้องสมุดไป่ตู้62） 适合制备大型转基因动物 对卵的机械损伤小 提高外源基因与核染色体接触的机会 提高外源基因的整合率
01
优良动物的育种：通过转基因可获得生长快速、品质良好、抗病力强、产量高的动物品种。
03
在异种器官移植中，通过转基因技术以期获得人类所需的不被免疫排斥的器官。
05
转基因动物模型与基因治疗
02
在医药领域：通过相应转入目的基因的动物获得所需的药物
04
生物反应器：P263－265 优点：易养殖、通过乳腺和血液制备活性物质简单易行 不足：制备转基因动物成本高 易产生一些伦理问题
曾溢滔院士预测称，目前一种新药从它的研制开发、通过药审、直到上市，约需10~15年。如果利用转基因动物-乳腺生物反应器，新药生产的周期为5年左右。
据悉，曾溢滔院士在1998年研制出转基因羊、1999年研制出转基因牛，这两项成果，震惊了世界，并连续两年获得两院院士评选的十大科技进展。
12.4 转基因植物生物反应器
方法：外源目的基因导入能进行体外培养的动物细胞，再以这些细胞作为核供体，利用克隆动物技术获得转基因动物。
优点（262）
获得转基因动物的效率高
通过鉴别核供体核型预知转基因动物性别
所需动物数量大为减少
生物反应器及其应用——转基因动物生物反应器
２ 动物生物 反应器的类型
２１ 动 物血液生物 反应 器 ．
近 年 来 ， 物 血 液 生物 反 应 器 取得 了很 大进 展 。 动 血 液 生 物 反 应 器 比较 适 合 生 产 人 血 红 蛋 白、 体 和 抗 纯 的特 点 ， 补 了其 它 各 类 基 因 表 达 系 统 的 缺 陷 。 弥 生产 非 生物 学 活 性 状 态 的融 合 蛋 白， 有 活性 的 蛋 而
维普资讯
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生 物 反 应 器 及 其 应 用
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转 基 因动 物 生 物 反 应 器
袁 明霞 ， 孙德 君 ， 万秋 杨
（ 黑龙 江 省 生 物 制 品 一 厂 ， 龙 江 哈 尔 滨 １ ０ ６ ） 黑 ５ ０ ９
【 中图分 类号 １ ８ ４８ ｓ １． 【 文献 标识 码 】 Ｂ 【 文章 编号 ］ ６ ２— ２ ７ （０ ７０ １７ ０ ８２ ０）６— 、 养 盐 、 他 命 和 氧 （ 好 氧 有 机 物 ） 营 维 对 来 畜 研 究 最 为 活 跃 的领 域 就 是 利 用 它 们 生产 新 的 动 支 持 这个 自然 过 程 ， 细胞 能进行 生 长和 新 陈 代谢 。 物 产 品 。通 常 把 目的基 因在 血 液 循 环 系 统 或 乳 腺 使
8 转基因生物反应器
动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达 的启动子元件构建转基因动物, 指导外源基因在乳 腺中表达, 并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。
乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊
动物乳腺生物反应器的应用
高乳汁营养价值 生产药用蛋白
患有庞普病的婴儿体内一种可促进糖原质代谢的酶有缺陷。 荷兰研究人员培育出一种转基因兔，兔奶中表达这种酶，因此 饮用这种奶可以治疗这种疾病。
两大缺陷：
Байду номын сангаас
一是细菌等微生物本身是低等生物，构建 好的哺乳动物或人类的基因导入后不能很 好表达。 二是即使表达了，产物往往没有活性，必 须经过糖基化、羧基化等一系列修饰加工 才能成为有效的药物。
转基因生物反应器
生物反应器（bioreactor）
生物反应器：一般是指用于完成生物催化反应的装置， 分为细胞反应器和酶反应器。
传统生物反应器 生物反应器 转基因生物反应器
细胞反应器 酶反应器 动物生物反应器 植物生物反应器 微生物生物反应器
微生物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
1 转基因动物反应器
概念1：转基因动物反应器是指从转基因动物体液或血液 中收获目标产物的生命系统。其原理是将编码活性蛋白的 基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，以制备转基因动物， 并使外源基因在动物体内（乳汁、血液）进行高效表达， 然后提取目的产物。 概念2：一般把目的基因片段在器官或组织中表达的转基 因动物叫动物生物反应器。
生物学转基因动物与动物生物反应器
基 因 打 靶 流 程 图
• 基因打靶的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和 同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技 术的进一步发展。
• 基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学 研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生 物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展， 成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效 的方法之一。
缺点：
转入的外源基因的大小受到限制, 一般在10kb 以下。
获得纯合体的转基因动物的机会少。 病毒载体构建复杂。 可能出现病毒自身基因的复制表达问题等。
3 胚胎干细胞（ES细胞）法
将外源基因导入体外培养的ES细胞。 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿
孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细 胞。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期 胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。
转基因动物的应用
（1）基因表达与调控的研究 将转基因导入动物受体细胞内,研究该基因在体
内的表达调控特征及其相应的生物学效应,这是转 基因动物的一种应用途径。 当转基因动物的外源目的基因插入某一内源基因 后, 可能会破坏该内源基因的功能,造成某一基因 功能的缺失。通过这种基因剔除的方法可阐明某 一特定基因在发育过程中的功能。
得纯系转基因动物。
Injection of ES cells into
blastocysts
优点：
外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定
位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法Fra bibliotek样，细胞鉴定及
筛选方便。 该方法遗传修饰能力强且十分精确,基因
目前, 已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞 贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真 皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾 病的研究提供了方便。
细胞工程-7.转基因动物与生物反应器
从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。
整理：灵魂的心碎 更多内容请联系 linghundexinsui@
■ 目的基因的选择
选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。
■ 体外重组
选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。
■ 基因转导
将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。
■ 胚胎移植
利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁，来获得目的基因表达产物。
━转基因技术:通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能够稳定地将此基因遗传给后代的技术。
━转基因动物:在基因组内稳定地整合外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。
━转基因动物细胞反应器制备流程
■ 外源目的基因的制备
■ 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
■ 选择获得携有目的基因的细胞
■ 选择合适的体外培养系统和宿主动物
■ 转基因细胞胚
■ 胎发育及鉴定
■ 筛选所得的转基因动物品系。
━生物反应器的类型
■ 动物血液生物反应器
■ 动物乳腺生物反应器
■ 动物膀胱生物反应器
动物乳腺生物反应器的制备
■ 表达载体的构建
目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件。
第9章 转基因动物与生物反应器
优点：
鸡输卵管是一个自我封闭的系统，肝脏 合成蛋黄中的蛋白质和脂肪，并由血液 直接输入输卵管，避免大量表达的外源 性蛋白质对鸡健康造成的危害。
产量可观，且成本低廉。
产品的活性接近天然产品
本章结束
在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将 DNA注射进去。
3、裸DNA直接转移法：效率低。
显微操作系统
二、化学方法
1、DEAE-葡聚糖介导法：效率低
(乙二胺乙基葡聚糖)
DNA上的磷酸带负电
DEAE带正电
→ DNA大颗粒→ 细胞胞饮
2、磷酸钙-DNA共沉淀法：效率低(P254)
表面活性剂
3.脂质体介导法(P255)
转基因动物乳腺生物反应器的优越性： 产品质量稳定，活性高； 可持续大量地表达； 成本低，经济效益显著； 无污染； 药物分离纯化工艺简便，可获得纯度
高达99%的产品； 研制开发周期短。
转基因动物乳腺生物反应器存在的问题：
转基因在受体动物基因组中随机整合， 有些存在调节失控、遗传不稳定、表达 率不高等问题
第9章 转基因动物 第9章与生转物基反因应动器物
与生物反应器
9.1 转基因技术
通过人工操作的方式将外源基因整合到 生物体基因组内，使该转基因生物能稳定 地将此基因遗传给后代的实验技术。
细胞转染外源基因分三步：
(1)选择合适的受体细胞; (2)有效的转染方法； (3)转化后的筛选。
细胞转染外源基因的方法：
9.2.1 转基因动物的制备
一、步骤： •外源目的基因的制备； •目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞； •选择获得携有目的基因的细胞； •选择合适的体外培养系统和宿主动物； •转基因细胞胚胎发育及鉴定； •筛选所得的转基因动物品系。
生物反应器
•
•
生物 反应器 生物 反应器
• 生物反应器潜在的社会价值是 无可估量的。在未来几年内， 将有多种动物乳腺生物反映器 重组蛋白上市，从而形成市场 前景广阔和利润巨大的新生物 制药行业。
张 鑫
王 吟
霍 博 超
目
录
• • • • • 概念 动物反应器 微生物反应器 植物反应器 家蚕反应器
概
•
念
生物反应器是利用生物体所具有的生物功能，在体外或 体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装 置系统、细胞、组织器官等等。 生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。 生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能， 设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者 说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有 的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种 生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反 应器等。
家蚕 反应器
桑蚕生物反应器主要有两种形式
1.转基因桑蚕(transgenic silkworm) 2.杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,BEVS)。
技术
力量
• 国内现有技术力量包括中科院上海生化与细胞研 究所、浙江理工大学、浙江大学、中山大学、中 科院武汉病毒所、中国农科院、南京大学、西北 农业大学等单位已基本建立工作基础。 • 中科院上海生化所在昆虫（家蚕）杆状病毒系统 和高效表达载体等上游工作具有较强优势。浙江 理工大学在家蚕生物反应器生产基因工程口服药 物及产业化和家蚕蛋白功能组学研究积累许多工 作基础，“家蚕生物反应器生产生物制品的方法” 获得了2004年国家技术发明二等奖。
• •
植物
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转基因动植物生物反应器
生物技术1002
摘要:生物反应器，指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。
随着转基因技术问世,生物反应器不再局限于传统“冷冰冰”的设备，而是富有生命特性的动植物。
动植物生物反应器指的是通过基因工程途径以常见的农作物或者活体动物，高效表达某种器官或组织，进行工业化生产功能蛋白等生物制剂。
本文为大家阐述了转基因动植物反应器的优缺点，研究进展及其应用。
关键词:转基因动物反应器，转基因植物反应器，优缺点，研究进展，应用
一、转基因动植物生物反应器的优缺点
1.1转基因动物生物反应器的优点
1易养殖，实现大规模制备。
2通过乳腺和血液制备活性物质简单易行。
3可以通过动物细胞培养实现大量制备。
4产量高，转基因动物在每升乳汁中可得几十克产物，而转基因植物，微生物在每升培养液中只能获得几毫克。
5成本低，用细菌、酵母菌或动物细胞生产基因工程药物，反应条件要求严格，而转
基因动物只需要正常饲养。
6用于转基因动物制药的受体牛、羊、猪等哺乳动物，与人类亲缘关系比细菌、酵母
菌要近的多，所以其产品具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性川。
7用转基因动物培植活体器官和组织，用于更替人体患病的器官和组织。
1.2转基因动物生物反应器的缺点
1细胞培养需要昂贵的培养基和设备。
2转基因动物制备成本昂贵。
3转基因动物易产生一些伦理问题。
4目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题"使得转入的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。
为确保转入的基因能得到高效表达并完全整合，关键是基因构建和位点整合。
5转基因表达产物的分离与纯化也存在问题，可能会出现要纯化的产物含量低的现象，还要确保去除引起人类变态反应的非人类蛋白。
6转基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似#转基因产品必须与人体产生的蛋白高度相似，以免人体对它产生免疫反应。
2.1转基因植物生物反应器的优点
1 比较廉价利用植物生产系统容易大规模生产来自动物、人类、细菌、病毒等的外源蛋白，成本低廉。
植物是最经济的蛋白质生产系统
2 合成外源蛋白相对比较安全细菌作为生物反应器时，不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工，而且本身可能是人类病原物。
植物生物反应器的表达产物具有无毒性和副作用,安全可靠,无残存DNA和潜在致病致癌性
3 植物转基因操作和克隆技术比较成熟在克隆技术方面，转基因动物的克隆还处于起步阶段，然而植物的克隆技术如组织培养、器官培养、细胞培养等已相当成熟。
4植物可以大规模种植,而且产物贮藏在种子、果实、块茎中便于贮运
5植物具有完整的真核细胞表达系统
6转基因植物自交后可得到稳定遗传的遗传性状。
2.2转基因植物生物反应器的缺点
1植物种植受季节、环境影响。
2需专门的活性物质分离设备与技术。
3植物细胞培养需要发酵罐等设备和技术支持，成本较高。
4转基因植物具有潜在的破坏生态环境的可能性
二、转基因动植物生物反应器的研究进展
1.1国内转基因动物生物反应器研究进展
我国对动物乳腺生物反应器的研究起步较早，上世纪80年代初，施履吉院士就提出了乳腺生物反应器的构想，并成功获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔子。
1996年，国家正式投资进行动物乳腺生物反应器的研究，并将它列入“九五”、“863”计划重大项目。
1998年，上海儿童医学院遗传研究所的曾溢滔和黄淑浈等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛。
2005年，李宁等在国际上首次利用体细胞克隆技术获得人乳铁蛋白基因和人"－乳清白蛋白转基因克隆牛这是我国第一次成功研制了具有商业开发前景的奶牛乳腺生物反应器。
2007年，周兴等用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织，产后奶样经纤维蛋白平板溶圈法检测蚓激酶活性，结果表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。
2008年，吴湃等用筛选出活性最强的重组β－酪蛋白启动子，构建出了新型的高效重组奶牛乳腺定位表达载体。
尽管我国在该项技术上取得了较大进展，但仍处于探索研究阶段。
1.1国外转基因动物生物反应器研究进展
自20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想以来，国外在此方面的研究取得了突破性进展。
1974年，Jaenish等应用显微注射法，在世界上首次获得A V40DNA转基因小鼠
1980年，Gordon等人育成带有人胸苷激酶的转基因小鼠
1983年，Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中
1987年，Gordon首次成功地从转基因小鼠的乳汁中获得了人类组织型溶酶原激活剂(tpa)，此举开创了新的研究领域，随后各国展开了大量的研究。
1990年，美国获得世界上第一头转基因公牛，该公牛可与非转基因母牛生产转基因后代，其1/4的后代母牛乳腺表达了人乳铁蛋白。
Park等于2006年通过精子微注射受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，Chan等通过反转录病毒感染技术获得了转基因奶牛。
目前，国外已初步形成了以转基因动物乳腺组织为主要生产手段的医药产业。
2.1国内转基因植物生物反应器研究进展
2000年，我国科学工作者首次在番茄果实中成功表达具有生物活性4连体胸腺素al(4×Ta1)E16]。
中国农业科学院生物技术研究所研发的转乙型肝炎病毒包膜蛋白基因(S2&S)马铃薯和番茄口服接种小鼠后可使小鼠产生特异性的保护抗体，已于2006年完成“生产性试验”阶段研究。
在国家863计划资助下，该所首次在国际上成功利用油菜油体表达体系表达了鱿鱼降钙素蛋白，2005年已获得农业部科技成果鉴定。
该种畦鱼降钙素类似物制备方法已获得国家发明专利授权，可用于新36高科技与产业化。
2008年，我国科学工作者首次在番茄果实中成功表达具有生物活性的4连体胸腺素，这是我国利用植物生物反应器表达药用蛋白的重要成果
2.2国外转基因植物生物反应器研究进展
1989年，Hiatt A等人将具有生物学活性单克隆抗体(monoclonal anbodies，mAbs)首次在转基因植物(烟草)中成功表达，开创了植物生产抗体的先河。
1992年Mason等率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路,并在转基因烟草中成功表达了乙肝表面抗原。
Ma等(1998)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpccus mutants)表面抗原的嵌合抗体IgA-G引入到烟草中，该抗体对抑制链球菌(Sreptpcpccus mutants)的作用与杂交瘤细胞产生的抗体一样。
临床实验证实，该抗体可以有效清除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)，并预防志愿者口腔产生龋齿。
Shchelkunov等（2006）首次研究了一种能同时抗两种病毒的疫苗，将编码艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因导入番茄并得以表达。
三、转基因动植物生物反应器的应用
1．表达抗体
Lai H, Engle M等（2010），将抵抗西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)的人类抗体蛋白基因导入烟草从而可以大量制造这种抗体蛋白，并且可以有效治疗小鼠的西尼罗河病毒感染。
2.药物筛选
3.生产其他药用蛋白或者生物制剂
如：用于血友病的人凝血因子IX、人凝血因子姗、凝血酶llI等;还有其他类药用蛋白如胶原、血纤维蛋白原、蛋白质c和组织纤维溶酶原激活子。
在林业、环保方面的应用。
转基因植物生物反应器除了在医药领域用于生产抗体、疫苗、药用蛋白等物质外，还可用于植酸、果糖等原料的生产，在食品、饲料工业等领域应用。
随着技术的不断成熟和完善，转基因动植物生物反应器的应用前景一片光明。
四、参考文献
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