双相电泳简易操作指南
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
BIO-RAD双向电泳中文手册
BIO-RAD双向电泳中文手册ProteomicBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册ProteomeWorkTMSytem双向电泳实验流程z样品制备（Samplepreparation）z固相预制胶条的水化（IPGtriprehydration）z第一向等电聚焦（IEF）z胶条的平衡（IPGtripequilibration）z第二向SDS-电泳（SDS-electrophrei）z凝胶的染色及检测（Detection/Staining）zPDQuet软件分析（Softwareanalyi）z质谱鉴定（Proteinidentification）目录第一章实验材料1．1IPG预制胶条及载体两性电解质1．2蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3试剂盒及其试剂1．4化学试剂1．5蛋白质Marker1．6染色试剂1．7注意事项第二章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1溶液的配制2.2SDS-凝胶的配制2.3操作方法2.4注意事项第三章双向电泳3.1溶液配制3.2操作步骤3.3注意事项附录1双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章实验材料1．1IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存IPG预制胶条pH3-10，7cm163-2000IPG预制胶条pH3-10，7cm，nonlinear（NL）163-2002IPG预制胶条pH4-7，7cm163-2001IPG预制胶条pH3-6，7cm163-2003IPG预制胶条pH5-8，7cm163-2004IPG预制胶条pH7-10，7cm163-2005IPG预制胶条pH3-10，17cm163-2007IPG预制胶条pH3-10，17cm，nonlinear（NL）163-2022IPG预制胶条pH4-7，17cm163-2022IPG预制胶条pH3-6，17cm163-2022IPG预制胶条pH5-8，17cm163-2022IPG预制胶条pH7-10，17cm163-2022IPG预制胶条pH3-10，18cm163-2032IPG预制胶条pH3-10，18cm，nonlinear（NL）163-2033IPG预制胶条pH4-7，18cm163-2034IPG预制胶条pH3-6，18cm163-2035IPG预制胶条pH5-8，18cm163-2036IPG预制胶条pH7-10，18cm163-2037IPG预制胶条pH3-10，11cm163-2022IPG预制胶条pH3-10，11cm，nonlinear（NL）163-2022IPG预制胶条pH4-7，11cm163-2022IPG预制胶条pH3-6，11cm163-2022IPG预制胶条pH5-8，11cm163-2022IPG预制胶条pH7-10，11cm163-2022IPG预制胶条pH3.9-5.1，17cm163-2022IPG预制胶条pH4.7-5.9，17cm163-2022IPG预制胶条pH5.5-6.7，17cm163-2022IPG预制胶条pH6.3-8.3，17cm163-2023IPG预制胶条pH3.9-5.1，18cm163-2038IPG预制胶条pH4.7-5.9，18cm163-2039IPG预制胶条pH5.5-6.7，18cm163-2040IPG预制胶条pH6.3-8.3，18cm163-2041IPG预制胶条pH3.9-5.1，11cm163-2024IPG预制胶条pH4.7-5.9，11cm163-2025IPG预制胶条pH5.5-6.7，11cm163-2026IPG预制胶条pH6.3-8.3，11cm163-2027IPG预制胶条pH3.9-5.1，7cm163-2028IPG预制胶条pH4.7-5.9，7cm163-2029IPG预制胶条pH5.5-6.7，7cm163-2030IPG预制胶条pH6.3-8.3，7cm163-2031Bio-Rad公司），4℃冰箱保存Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，10ml163-1112Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，25ml163-1113Bio-Lyte3/5Ampholyte，20%，10ml163-1132Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，10ml163-1142Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，25ml163-1143Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，10ml163-1152Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，25ml163-1153Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，10ml163-1162Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，25ml163-1163Bio-Lyte7/9Ampholyte，40%，10ml163-1172Bio-Lyte8/10Ampholyte，20%，10ml163-1182Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，10ml163-1192Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，25ml163-1193Bio-Rad公司），4℃冰箱保存100某ReadyStripBuffer，forpH7-10IPGStrip，1ml163-2093Bio-Lyte3/10Ampholyte，100某，1ml163-2094100某ReadyStripBuffer，forpH6.8-8.3IPGStrip，1ml163-2095100某ReadyStripBuffer，forpH5.5-6.7IPGStrip，1ml163-2096100某ReadyStripBuffer，forpH4.7-5.9IPGStrip，1ml163-2097（二）载体两性电解质（美国（三）等电聚焦上样缓冲液（美国100某ReadyStripBuffer，forpH3.5-5.1IPGStrip，1ml163-20981．2蛋白质定量试剂盒及其试剂ProteinAayKitI，bovineγ-globulintandard500-0001ProteinAayKitII，BSAtandard500-0002ProteinStandardI，bovineγ-globulin，1bottle500-0005ProteinAayDyeReagentConcentrate，450ml500-0006ProteinStandardII，bovineerumalbumin，1bottle500-0007RCDCProteinAayKitI，bovineγ-globulintandard500-0121RCDCProteinAayKitII，BSAtandard500-01221．3试剂盒及其试剂ReadyPrepSequentialE某tractionKit163-2100Tributylphophine （TBP），200mM，0.6ml163-2101ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent1，1vial163-2102ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent2，1vial163-2103ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent3，1vial163-2104ReadyPrep2-DStarterKit163-2105ReadyPrep2-DStarterKitRehydration/SampleBufferReadyPrepStarterKitEquilibrationBufferI，withDTT163-2107ReadyPrepStarterKitEquilibrationBufferII163-2108Iodoacetamide，30g163-2109E.coliProteinSample，lyophilized，2.7mg163-2110ReadyPrepOverlayAgaroe，50ml163-21111．4化学试剂尿素Urea，250g尿素Urea，1kgAG501-某8（D）Mi某edBedRein142-6425CHAPS，1g161-0460CHAPSO，1gTriton某-100，500ml161-0407DTT（Dithiothreitol），1g161-0610DTT（Dithiothreitol），5g163-2106161-0730161-0731161-0465161-0611Tributylphophine（TBP），200mM，0.6ml163-2101溴酚蓝（BromophenolBlue），10g161-0404矿物油（MineralOil），500ml163-2129SDS，25g161-0300SDS，100g161-0301SDS，1kg161-0302Tri，100g161-0715Tri，500g161-0716Tri，1kgIodoacetamide，30g163-2109低熔点琼脂糖，25g甘氨酸，250g161-0717甘氨酸，1kg甘氨酸，2kg丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g161-0100丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g161-0101丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg161-0103丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg161-0107丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg161-0108甲叉双丙烯酰胺（Bi），5g161-0200甲叉双丙烯酰胺（Bi），50g161-0201PDA （PiperazineDiacrylamide），10g161-0202PDA （PiperazineDiacrylamide），50g161-0203过硫酸氨（AmmoniumPerulfate），10g161-0700过硫酸氨（AmmoniumPerulfate），100g161-0754TEMED，5mlTEMED，50ml161-0801甘油硫尿Marker2-DSDS-Standard，500μl161-0320SDS-Standard，highrange，200μl161-0303SDS-Standard，lowrange，200μl161-0304161-0719161-3111161-0718161-0724161-0800国产或SigmaSigma1．5蛋白质SDS-Standard，broadrange，200μl161-0317PolypeptideSDS-Standard，200μl161-0326PreciionProteinStandard，untained，1500μl，150application161-0362PreciionProteinStandard，pretained，500μl，50application161-0372KaleidocopePolypeptideStandard，500μl161-0325KaleidocopePretainedStandard，broadrange，500μl161-0324PretainedSDS-Standard，highrange，500μl161-0309PretainedSDS-Standard，lowrange，500μl161-0305PretainedSDS-Standard，broadrange，500μl161-0318IEFStandard，pIrange4.45-9.6，250μl161-0310CoomaieBrilliantBlueR-250，10g161-0400CoomaieBrilliantBlueG-250，10g161-0406IEFGelStainingSolution，1L161-0434CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolutionKit161-0435CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolution，1L161-0436CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolution，4某1L161-0437CoomaieBrilliantBlueR-250DetainingSolution，1L161-0438CoomaieBrilliantBlueR-250DetainingSolution，4某1L161-0439Bio-SafeCoomaieStain，1L161-0786Bio-SafeCoomaieStain，5L161-0787SYPRORubyProteinGelStain，200ml170-3126SYPRORubyProteinGelStain，1L170-3125SYPRORubyProteinGelStain，5L170-3138SilverStainKit161-0443SilverStainPluKit161-04501.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
双向电泳泳实验方案
双向电泳实验方案1.双向电泳总蛋白(培养细胞）提取方法：方案一细胞培养在10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。
（折合在六孔板中，每孔加裂解液50μl）之后将样品用超声波细胞破碎仪超声处理超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100-120W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止，处理过程在冰浴中进行，超声处理后，4℃、25000g离心1h。
取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后-80℃冰箱中保存。
（裂解液成分：8mol/L脲，65mmol/L DDT，4％CHAPS，40mmol/L Tris）方案二1.1试剂（1）抽提缓冲液9mol/L脲 5.4g4％CHAPS 0.4g0.5％IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech） 50.0μl50mmol/L DDT 0.077gH2O 加至10ml（2）IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech）(3) 磷酸盐缓冲液（PBS）,冰冻1.2仪器(1) 细胞刮刀（2）离心机（低温，低速）（3）滤纸（4）冰浴装置（5）超速离心机（低温）（6）漩涡混合器1.3细胞培养的GC-1 spg细胞1.4方法1.从培养皿中转移细胞：用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml移液器将培养基和细胞转移至15ml离心管中。
2.480g、4℃离心沉淀细胞5min。
3.弃去上清，勿搅动沉淀要点：操作一下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或震荡时保持细胞在冰上。
4.离心管中加入10ml冰冻PBS,来回吹打重悬细胞。
5.480g、4℃再次离心细胞5min。
6.弃去上清，勿搅动沉淀。
7.重复步骤4-6两次。
8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。
9.用移液器将抽提缓冲液加到离心管中。
依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
双向电泳实验操作流程
双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。
根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。
考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。
2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。
DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。
清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。
3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。
上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。
以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。
说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。
在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。
上样后即可进行IEF电泳。
注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。
一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。
4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。
将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。
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目录第一章样品制备 21.1 一般性原则 21.2 样品制备程序 3 1.2.1 培养细胞样品处理方法 31.2.2 组织样品处理方法 31.2.3文献报道较多的裂解液配方 4第二章第一向等电聚焦（IEF） 72.1 IPG胶条的水化和电泳 72.1.1 仪器 72.1.2 试剂 72.1.3 实验步骤 72.2 IPG胶条的平衡 92.2.1 仪器 102.2.2 试剂 102.2.3 实验步骤 10第三章第二向SDS电泳 123.1 垂直SDS-PAGE 123.1.1 溶液 123.1.2 灌胶步骤 123.1.3 电泳步骤 14第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 154.1 考马斯亮兰染色 154.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 154.1.2 Neuhoff胶体考染法 154.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 164.2 硝酸银染色 16Appendix I Troubleshooting 18Appendix II Solutions 232DE分析流程：样品制备（Sample preparation）固相pH梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）第二向SDS电泳（SDS-PAGE）检测染色（Detection/Staining）第一章样品制备（Sample Preparation）1.1一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。
目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。
当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。
通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。
在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。
样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。
脂类和多糖都可以通过超速离心除去。
透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。
1.2样品制备程序：1.2.1培养细胞（culture cell）样品处理方法：培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。
裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.其他常用的裂解缓冲液如下：(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;(C) 加入0.3-1% SDS在95o C煮样品5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。
总蛋白抽提程序：（1）培养细胞的收集；（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof管中，吸干残留的PBS；（4）加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100µL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5）4o C，40,000g，离心1h；（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C备用。
1.2.2组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。
但遵循的原则基本相同。
下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。
三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1）在液氮中研碎叶片；（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20o C的冰浴；（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4o C，40,000g, 1h），弃上清；（4）重悬沉淀浮于含0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；（5）离心（4o C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4o C，40,000g, 1h）。
（7）Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C 备用。
超速离心法：（1）取材；（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；（3）组织悬液15℃，10 000×g离心10 min；（4）上清液4℃，150 000×g超速离心45 min；（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min；（6）取离心上清。
Bradford法定量，分装后置–75℃保存。
1.2.3 文献报道较多的裂解液配方Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of proteaseinhibitors)Final concentration Amount9 M 10.8 gUrea (FW 60.06,Sigma, >99.5%)CHAPS (FW 614.89,4% (w/v) 0.8 gSigma, >98%Ultrapure H2O to 20 mlprepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail ofprotease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 gCHAPS 4% (w/v) 0.8 gTris base (FW 121.1)Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final conc. AmountUrea 5 M 3.0 gThiourea (FW 76.12) 2 M 1.52 gSB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 gCHAPS 2% 0.2 gUltrapure H2O to 10 mlA cocktail of proteaseinhibitorsDTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysisbuffer (15.5×stock),-20℃Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加tris可不用此混合物）成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF 35 μg/ml or 1 mMEDTA 0.3 mg/ml (1 mM)抑肽素0.7 μg/ml亮肽素0.5 μg/ml其中C-F是分步法提取的4种裂解液配方, C适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。
欲了解更详细的样品制备信息，可参考：/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.第二章第一向等电聚焦（IEF）双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。
IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。
可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。
IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。