生物药物综合实验----植物原生质体的制备
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
原生质体的制备方法
原生质体的制备方法
嘿，朋友们！今天咱来聊聊原生质体的制备方法，这可真是个有趣又重要的事儿呢！
你想想啊，原生质体就像是一个小生命的核心部分，要把它弄出来可不容易，但咱有办法呀！
首先呢，得选个好材料。
就像做饭得挑好食材一样，这材料要是不好，后面可就难搞啦！得找那种容易分离原生质体的植物组织或细胞。
然后呢，就是处理啦。
这就好比给它来个精心的打扮。
一般会用到一些酶来分解细胞壁，让原生质体可以“脱身”。
这酶可不能乱选哦，得选合适的，就像钥匙得配对锁一样。
在这个过程中，时间和条件都很关键呢！时间长了不行，短了也不行，温度啊、酸碱度啊都得恰到好处。
这可真是考验咱的耐心和细心呢！要是不小心弄错了一点，哎呀，那可就前功尽弃啦！
还有啊，操作的时候可得轻点儿，别把原生质体给弄伤了。
这就像对待一个小婴儿，得小心翼翼地呵护着。
等原生质体分离出来后，还得好好地培养它。
给它提供合适的环境，让它能茁壮成长。
这就像给小树苗浇水施肥一样，得用心照顾。
你说这原生质体的制备是不是很神奇？就像变魔术一样，把一个小小的细胞变成了我们可以研究和利用的宝贝。
咱通过制备原生质体，可以更好地了解细胞的特性和功能，还能进行各种实验和应用。
这对生物学的发展多重要啊！
所以啊，大家可别小看了这原生质体的制备，它可是开启很多科学奥秘的钥匙呢！好好去尝试，去探索，说不定就能发现很多新奇的东西哦！反正我是觉得这真的超级有趣，超级有意义的啦！
原创不易，请尊重原创，谢谢!。
原生质体的制备
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题
1、何为原生质体
2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
其原理是根据由纤维素酶果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用而使原生质体释放出来
目的要求
掌握植物原生质质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
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生物技术大实验实验指导
生物技术大实验实验指导——原生质体的制备、再生一、实验名称：原生质体的制备、再生二、实验目的：通过本实验掌握丝状真菌原生质体制备和再生的技术和原理，并能将该技术应用于育种和遗传研究。
三、实验原理：微生物的细胞或菌丝在细胞壁被脱去或降解后所形成的圆球体，称为原生质体。
真菌细胞壁的主要成分为己糖或氨基己糖构成的多糖链，如几丁质、脱乙酰几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。
此外，还有蛋白质、类脂、无机盐等。
所有真菌的细胞壁都具有无定形的和纤维状的组分。
纤维状的组分包括几丁质和纤维素，都是由多聚物形成的微纤丝。
无定形的组分包括蛋白质、甘露聚糖和β-(1,3)、和β-(1,6)、α-(1,3)葡聚糖，常混杂在纤维网中，但大多数真菌，包括子囊菌、担子菌、半知菌类和低等壶菌的细胞壁由几丁质（β-1,4-N-乙酰氨基葡糖为单元的无支链多聚体组成）。
细胞壁的成分随真菌类群的不同而变化，并且每种菌体的细胞壁在其生活周期的过程中也存在差异。
最早的脱壁方法是用机械的方法剥离细胞壁来制备植物细胞的原生质体。
1960年前后开始有大量关于用酶法制备植物和微生物原生质体的报道。
此后虽然也有人尝试过用物理方法（如研磨和超声波等）制备原生质体，但远不如酶法普遍。
酶法制备原生质体最关键的是根据不同物种的细胞壁的结构及其化学组成选用具有不同酶活性的脱壁酶。
真菌原生质体以广泛地应用于原生质体融合育种，质粒、线粒体等外源DNA 的原生质体转化，细胞壁的重建以及生理生化研究等方面。
因而，无论在理论上还是在应用上，原生质体的研究均引起了人们的浓厚兴趣。
近几年来，真菌原生质体的研究对象已从实验室模式种逐渐转向具有工业价值的生产种，以期获得更好的经济效益。
四、材料1、菌种：蛹虫草拟青霉。
2、培养基：（1）菌丝生长培养基PDA培养基：马铃薯20 g（去皮切片煮沸30 min，过滤去渣）；葡萄糖2g；琼脂1.5g；蒸馏水100 ml；自然pH。
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
植物原生质体的培养方法和步骤
NaH2PO4·2H2O
2mmol/L
甘露醇
0.5mol/L
3）Kg 培养基
大量无素： 微量元素：
KNO3
2500
MnSO4·4H2O
10
NH4NO3
250
ZnSO4·7H2O
2
(NH4)2SO4
134
H3BO4
3
MgSO4·7H2O
250
KI
0.75
CaCl2·2H2OLeabharlann 900Na2MoO4·5H2O
植物原生质体的培养
一. 实验目的：
通过实验掌握原生质体的获得与培养技术
二. 实验原理：
植物原生质体就是除去了细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞，用酶降解法脱
去细胞壁的具有活力的原生质体，其在合适的离体培养条件下具有繁殖，分化，再生成
为完整植株的能力。利用原生质体便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问题，
果胶酶 R—10
0.8%
因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储备液灭菌，待用时再将酶制剂按
比例加入到第一步已灭菌的溶液内。
（3）一般酶制剂都不太纯，配好后要经 3500rpm 离心 5min，弃去其中杂质，吸取
上清液备用。（所用离心管、滴管等均应经过高压灭菌）
2）洗液
CaCl2·2H2O
8mmol/L
如质膜的表面特性，细胞壁的形成，细胞器的摄取，体细胞的杂交及作为基因式程研究
的良好受体系统，通过导入特定基因，获得转基因植株等等。植物原生质体作为一种研
究系统，如同在细胞水平上研究某些问题，比在组织、器官或个体水平上有方便之处。
三、实验材料，试剂和仪器
1．材料
无菌烟草叶片
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实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
北京电子科技学院----生物系 北京电子科技学院----生物系 ----
生物药物综合实验
王维彬
实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题
实验 八
植物原生质体的制备
实验目的
学习用酶溶解细胞壁的方法制备原生质体，为细胞 学习用酶溶解细胞壁的方法制备原生质体， 生理研究提供必要基础。 生理研究提供必要基础。 掌握植物原生质体分离的基本原理及其操作过程
实验器材
材料： 材料：油菜或菠菜或烟草叶片 试剂： 试剂： （1）酶混合液 1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇 0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.0
（2）12%甘露醇 （3）0.16mol/L CaCl2 （4）20%蔗糖液 仪器：离心机、显微镜等 仪器：
（4）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色 600rpm离心10分钟， 离心10分钟 便是纯净的原生质体。 带，便是纯净的原生质体。
4、原生质体的观察 用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上， 用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上， 用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。 用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。
2. 酶解 将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液5ml到 将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液5ml到 5ml 培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。 培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。黑暗下酶 1.5小时 中间轻晃几次。 小时， 解1.5小时，中间轻晃几次。
3. 原生质体的收集与纯化 （1）将酶-原生质体混合液收集于10mL刻度离心管中， 将酶-原生质体混合液收集于10mL刻度离心管中， 10mL刻度离心管中 盖盖，600~800r/min离心7min，使原生质体沉降。 离心7min 盖盖，600~800r/min离心7min，使原生质体沉降。
（2）去上清液，留沉淀即收集的原生质体。向离心管中 去上清液，留沉淀即收集的原生质体。 缓缓加入0.16mol/L氯化钙液约2mL 轻轻吹打均匀， 0.16mol/L氯化钙液约2mL， 缓缓加入0.16mol/L氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀， 使沉淀悬浮。 使沉淀悬浮。
（3）用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖液约2— 用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖液约2 20%蔗糖液约 3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。