纤维素分解菌的筛选方法
筛选纤维素分解菌的实验流程
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高效纤维素降解菌的筛选[1]
![高效纤维素降解菌的筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/07e44f56312b3169a451a439.png)
mL - 1 mL - 1
X21 14
9
X22 16
11
X23 10
7பைடு நூலகம்
Z21 18
22
Z22 73
35
Z23 54
29
Z24 22
18
Z25 55
24
透明圈 直径
1. 1 1. 3 1. 0 1. 5 3. 4 2. 0 1. 5 1. 2
CM C 酶 FPA 透明圈 菌种 U · U · 直径
mL - 1 mL - 1
21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5
0. 000 0. 264 0. 427 0. 592 0. 754 0. 811 1. 112
DN S 法测糖。在上述条件下, 定义每分钟催化纤维素
水解生成 1 Λg 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U 。
滤纸酶活 (FPA ) 的测定 将新华 1 号滤纸 (1
2. 2. 1 GL C 标准曲线 用 DN S 法, 在波长为 520 nm 条件下, 测定一
系列已知样品, 制备标准 GL C 曲线, 制备过程见表 1, 绘制结果见图 2。
表 1 葡萄糖标准曲线测定结果
含糖总量 m g 葡萄糖液 mL 蒸馏水 mL DN S 试剂 mL 加热 冷却 蒸馏水 mL 光密度 O. D.
Keywords: Screen ing Cellu lo se2decom po sing M icroo rgan ism s
植物纤维素约占植物体干重的 33. 4%～ 50% , 是地球上最丰富的有机物质。但是, 由于纤维素中存 在许多高能的氢键, 因此其水解、利用均很困难。 世 界上平均每年约生成 1500～ 2000 亿 t 植物性有机 物, 其中约有一半为纤维素类物质, 仅能利用一小部 分。绝大部分都被弃置[1], 因此如何更有效地开发和 利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。 能够降解纤维素的微生物有很多, 可是目前的研究 却大多集中在有限的几个菌株上, 如康宁木霉、里氏 木霉等。然而这些菌株仍然存在着产酶成本高, 酶活 性不稳定, 作用 pH 范围狭窄等问题。 因此寻找更 多、更高效、作用范围更广泛的新菌种是十分必要 的。作者研究比较了几种纤维素降解菌筛选方法, 并 从自然界筛得高效纤维降解细菌 1 株, 真菌 3 株。该 细菌可在 4 d 内将滤纸平板完全降解为粘质, 初步 鉴定为嗜纤维菌属。 此外, 3 株真菌均为木霉菌, 降 解活性也很高, 其中一株在发酵培养第 6 d, 滤纸酶 活 (FPA ) 即可达到 51 U mL。
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
研究纤维素降解菌的有关方案
纤维素降解菌的筛选及酶学性质的研究1.采样腐烂的苹果、蘑菇培养基及地面下10cm处土壤等2.富集培养(1)配制300ml 选择培养基。
(2)在250ml 锥形瓶中装入90ml 培养基（三瓶），放5-8 颗玻璃珠，塞上瓶塞，在121℃下高压蒸汽灭菌22min。
(3)每一份土样各取10g，在无菌条件下加入装有90ml 选择培养基的锥形瓶中，锥形瓶标上相应的标号。
(4)将瓶置于摇床上，在30℃下振荡（150rpm 左右）培养3-4d，至培养基变浑浊。
3.培养基1. 纤维素平板培养基CMC 20 g；KH2 PO4 2 g；ZnCl20.0017g ；MnSO40.0016g ；CoCl20.002 g ；MgSO4 ·7H2O 0.3 g ；(NH4)2 SO41.4 g ；CaCl20.3 g；FeSO4 0.0005g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL；pH7.0-7.22. 刚果红纤维素鉴别培养基KNO32 g ；MgSO40.5 g ；KH2 PO41 g ；NaCl 1 g；Na2 HPO 41 g ；CMC-Na 20 g ；刚果红0.2 g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL3. 液体发酵培养基蛋白胨3 g ；硫酸铵2 g ；酵母膏0.5 g ；KH2 PO4 4 g ；CaCl2 ·2H2O 0.3 g；MgSO4 .7H2O 0.3 g；Tween-80 0.2 mL；CMC 20 g；蒸馏水1000 mL4. 菌种保藏培养基（PDA）马铃薯200 g ；葡萄糖20 g ；琼脂15 g ；蒸馏水1000 mL ；pH自然5. 选择培养基CMC-Na5g，NaNO3 1g，KCl 0.5g，酵母膏0.5g，水解酪素0.5g。
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml。
4.基本实验步骤1.纤维素降解菌的初筛称取样本10 g ，放入盛90 mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20 min ，使土样与水充分混合，将细胞分散，用一支无菌移液管从中吸取1 mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、不同稀释度的土壤溶液。
纤维素分解菌的分离筛选
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ｃ ￣ｌ ｇ ｓ ｌｔ ｌ ／ ｉ ／
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ａ ｄａ ｐ ｔｅ ｉ ｈ ｏｒｓｏ ｄｎ ｎ ｕ ｔｅ ． ｎ ｐ ｈ ｍ ｔｅｃ ｒｅｐ ｎ ｉｇｉｄ ｓｒ ｓ ｎ ｉ Ｃ ｌ ｏｅ ｄ ｃｍｐ ｓ ｇｍｉｒ ￣ｎｓ ； ｎ ｙ ｃｉｉ ； ｃｅｎｎ ｅ ｕ ｓ－ ｅｏ ｏ ｉ ｌ ｎ ｃｔ ｍｒ ｉｍｓ Ｅ ｚｍｅａ ｔ ｔ Ｓｒｅ ｉｇ ｖｙ
Байду номын сангаас
纤维素分解菌的选择培养基中
• • • •
【 例 1】 微 生 物 体 内 能 够 使 纤 维 素 分 解 成 纤 维 二 糖 的 酶 是 ( )。 A．C1酶和Cx酶 B．C1酶和葡萄糖苷酶 C．Cx酶和葡萄糖苷酶 D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 深度剖析 纤维素酶包括 C1 酶、 Cx 酶和葡萄糖苷酶，能将 纤维素分解为纤维二糖的是C1酶和Cx酶。 答案 A
土壤取样
1、本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样成的菌悬 液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择 培养基上。其他步骤基本一致.
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
梯度稀释
按照课题1 的稀释操作方法，将选择培 养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数 到106
将样品涂布到鉴别纤维 素分解菌的培养基上
1、制备培养基:参照旁栏中的比例
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各 取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养
挑选产生透 明圈的菌落
参照课本刚果红染色法，挑选产生透明 圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落
答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分 解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通 环境。
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖 土，多年积累的枯枝败叶等。 ④讨论:如果找不到合适的环境，可将 滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什 么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对集中，实际上是人工设置纤维素分解 菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深 约10cm左右的土壤中。
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。
纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。
在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。
一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。
这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。
1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。
常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。
（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。
在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。
（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。
二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。
常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。
（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。
2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。
（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。
纤维素分解菌的筛选
５ ，Ｎ Ｃ １ ｇ ｇ ａ １０ ，加蒸 馏水 定容 至 １ ０ ｍＬ ０ ０ ，调 整ｐ 值 Ｈ
至 ７０。 ．
１１ ．３真 菌培养基 ． （ ） 面种子培养基 （ ／ １ 斜 ｇ Ｌ）：马铃薯２ ０ ，蔗糖 ０ｇ
２ｇ ０ ，琼 脂 粉 ２ ｇ ０ ，加 蒸 馏水 定 容 至 １０ ｍ ，无 需 调 整 ０ Ｌ ０
１． ． ２细菌培养基 １
Ｌ 培养基 （ ／ Ｂ ｇＬ）：胰 化 蛋 白 胨 １ｇ Ｏ ，酵母 提 取 物
掉 ，不 但破 坏 了生 态平衡 ，污染环 境 ，还存 在火灾 隐
患 。发展 和利用生物技术 分解转化天然纤维素原料既是 资源利用 的有效途径 ，而且对于解决环境污染 、粮食短
缺 和 能 源危 机 也 具 有 重大 的现 实 意 义 。 纤 维 素 酶 可 以 分 解 纤 维 素 ，它 广 泛 存 在 于 自然 界
为人类发展 ｑ的紧迫课题 。本试验 以土壤 为样本 ，利 用刚果红纤维素培养基进行初 筛， － ＿ 用麦秸粉 固体发 酵培养基复 筛，获得 了具有较 强纤维素分解能力的真菌。
关 键 词 ：纤 维 素 酶 ；真 菌
天然纤 维素 原料是 地球上最 丰 富的可再生 有机物
行研究 。并希望以此为基础进行更为深入 的研究 。
然 这 是 生 态 系 统 中碳 循 环 的一个 重 要 环 节 ，但从 人 类 利
取 四川 省 大 邑 县 及 崇 州 县 的 土 样 各 １ ０ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｇ ０ ０ ，分 别 放 入塑 料 袋 中 ，带 回实 验室 。
用 自然资源的角度看 ，无疑是巨大的浪费。在我 国，大 部分 秸秆 和树林 副产品被 用作燃料 或在 田间被直 接烧
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纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。
研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。
纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。
1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。
2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。
3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。
4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。
5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。
6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。
通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。