碱性磷酸酶(AKP)
碱性磷酸酶高
碱性磷酸酶高【导读】碱性磷酸酶（ALP或AKP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
临床上测定碱性磷酸酶，用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断。
碱性磷酸酶高可能是生理性原因，也可能是病理性原因。
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碱性磷酸酶高一般是指碱性磷酸酶检查中碱性磷酸酶的值高于正常参考值范围。
碱性磷酸酶高的正常参考值为：女性的正常参考值是50～135U/L，男性的是45～125U/L。
碱性磷酸酶广泛存在于人体各器官组织中，以肝脏细胞中最多，许多人对碱性磷酸酶陌生。
平时到医院临床进行肝功能检查时，结果中会包含碱性磷酸酶（ALP或AKP）这项，部分人会出现碱性磷酸酶偏高的现象。
如果检查发现碱性磷酸酶高，不要着急，而是要了解清楚为什么会偏高，再对症下药。
尤其是对于发育期的儿童、孕妇、以及处于骨折愈合期这三类人群，碱性磷酸酶高是较常见的，因此也要格外注意，可以定时到医院进行检查，使其不至于偏高很多，控制在一定范围内。
碱性磷酸酶高的原因根据科学研究证明，碱性磷酸酶高的主要原因主要有以下几点：1、某些药物导致。
临床患者采用抗生素（红霉素、庆大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等）进行治疗时，会导致碱性磷酸酶偏高，同时，用巴比妥类药物治疗时也会出现碱性磷酸酶偏高。
像这种药物导致的碱性磷酸酶偏高，一般是不需要进行特殊的治疗，停药后即恢复正常。
2、骨骼疾病。
由于骨组织中碱性磷酸酶也很活跃，因此如果有骨骼疾病的患者会出现碱性磷酸酶偏高。
如：佝偻病、软骨病、骨折愈合期、骨质疏松、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等骨骼疾病的患者一般会出现碱性磷酸酶偏高。
3、肝胆疾病。
由于肝脏细胞中碱性磷酸酶最多，因此如果肝胆出现问题，碱性磷酸酶偏高是必然的。
临床如：阻塞性黄疸、病毒性肝炎、肝癌（原发性、继发性）、肝硬化、胆汁淤积性肝炎等都可引起碱性磷酸酶偏高。
碱性磷酸酶(AKP)
AP的生理及研究作用
①可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分
泌及骨化过程中发挥了重要作用 ②在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性内切 酶切割后的载体DNA，去除载体DNA两末端的5′-磷 酸残基，以防止载体DNA自我环化，从而提高其重
组效率 。
谢谢
金属离子的作用
②酶与底物以金 属离子Zn为桥接 点，金属将底物 磷酸引导到正确 的位置（Ser-活 性部位），使酶 促反应顺利进行。
金属离子的作用
③金属Zn1中和
离去基团的负电
荷，是RO―能
够顺利离去。
金属离子的作用
④Mg定位了水
分子，催化Ser-
102的质子化和
去质子化的反应。
金属离子的作用
Zn1原子配位的氢氧根离 子进攻磷酸基，形成POH键，最终形成无机磷 酸盐与底物的非共价结 合形式。
碱性磷酸酶的提取
b）利用分光光度计测吸光度
c）设计标准曲线计算蛋白质含量
使用BCA法测定蛋白含量的原因
a) 对酶的比活力测定中蛋白定量发现BCA法在本样品体系中灵敏度 高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。
b）与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试 剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中.
提取操作流程 a）
取动物组织于 研钵中剪碎
加0.01M醋酸镁0.01M醋酸钠
滤液
(V)
弃渣
室温静置20分钟 用滤纸过滤
研磨2-3分钟
转移入刻度 离心管
于离心管中加 入正丁醇，用 玻棒充分搅拌
2分钟左右
提取操作流程 b）
滤液
(V)
加入等体积冷丙酮，立即 混匀后离心（200上清液
加入0.5M醋酸镁，用玻棒充分 搅拌,记录体积(V1)
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)，使乙醇终浓度达30%
向溶液中缓慢加入95%冷乙醇X1ml (X1=0.46V1)使乙醇终浓度达30%
b) 原理：在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠， 苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生 成红色醌亚衍生物。测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大 小。
② AKP的蛋白含量测定—BCA法
原理：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合 一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质 将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色 复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
医学检验·检查项目：碱性磷酸酶(ALP,AKP)_课件模板
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相关症状： 碱性磷酸酶增高、婴儿肋骨外翻、黄疸、 腹部肿块、腹水、食欲异常。
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临床意义：
④变形性骨炎、成骨细胞癌、佝偻病、 骨软化、甲状腺及甲状旁腺功能亢进、肾 小管性酸中毒、遗传性磷酸酶过多症 ⑤ 很多药物可使碱性磷酸酶增高，如巴比妥 类、抗生素(红霉素、庆大霉素、氯霉素、 卡那霉素、氨苄青霉素等)。 减低： 常 见于重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病 质、儿童甲状腺功能不全或
医学检验·各论 碱性磷酸酶(ALP,AKP)
内容课件模板
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简介： 碱性磷酸酶是一种磷酸单酯酶，广泛
存在于人体组织和体液中，以骨、肝、乳 腺、肠粘膜、肾，胎盘中。
医学检验·各论：Biblioteka 性磷酸酶(ALP,AKP) >>>
临床意义：
增高： ①阻塞性黄疸、肝硬化、肝 坏死，碱性磷酸酶明显升高(肝细胞性黄 疸则升高不明显)。 ②原发性和继发性肝 癌时碱性磷酸酶亦明显升高，与癌组织中 或癌肿周围肝细胞合成碱性磷酸酶增加有 关。 ③其他肿瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢 癌、骨细胞瘤、骨肉瘤等，碱性磷酸酶增 高时，提示可能有肝脏转移。
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临床意义： 减退、维生素C缺乏症坏血病)。营养不良、 呆小症、遗传性低磷酸酶血症。
生化大实验--AKP(碱磷酶)的表达与纯化
三、AKP表达纯化
实验设计
培养表达，收集菌体 表达菌体超声破碎
纯化监测
紫外监测
高速离心去沉淀
浓度测定
离子交换层析粗分离
OD280
加热除杂,高速离心
比活力
硫铵沉淀富集
SDS-PAGE
分子筛层析进一步分离
透析浓缩
纯化方案的评估
组分 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 体积 mL 蛋白 mg/mL 总蛋 白 mg 活力 U/mL 总活 力 U 比活力 U/mg 提纯 倍数 1 回收 率 100％
5. 鉴 定 方 法 电泳：琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳 免疫分析：凝集反应、免疫扩散、固相免疫吸附、 免疫印迹等 色谱：气相色谱、高压液相色谱、质谱 特定的化学反应、PCR、生物芯片、DNA测序、 DNA重组杂交技术、表型变化等 6. 标记技术 7. 实验数据的测量、记录、处理与分析 8. 试剂的配制与保存 9. 样品的保存与处理
相对误差：绝对误差在真实值中所占的百分率。
精确度和偏差：精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近 的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。 偏差：绝对偏差、相对偏差。
误差来源
1、系统误差（可测误差）： 测定过程中，某些经常发生的原因所造成的，它对测定结果的影响比较稳定， 在同一条件下重复测定中常重复出现，使测定结果不是偏高，就是偏低，而 且大小有一定规律，它的大小与正负往往可以测定出来，至少从理论上来说
提高实验准确度的方法
减少系统误差：
设置标准对照和空白试验 、校正仪器 减少偶然误差： 平均取样、多次取样 减少责任误差： 提高认识、端正实验态度、加强管理等
分子筛层析：
将上述离心上清上样、洗脱（Buffer A）
洗脱流速为15 mL/小时，每管接收2 mL
生物化学大实验-akp的浓度测定与活性检测
用于制备样品和分离细 胞或组织中的不同组分。
用于保持反应温度恒定。
用于精确移取一定量的 样品和试剂。
PART 04
实验步骤与方法
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定步骤与方法
准备试剂和设备
01
根据实验要求准备所需的试剂和设备，如AKP标准品、酶标仪、
酶标板等。
配置标准品溶液
改进建议
为了更准确地测定AKP的浓度和活性，建议采取以下措施：首先，确保试剂的纯度，避免使用含有杂质或污染物 的试剂；其次，严格控制实验条件，如温度、pH值等，确保实验条件的一致性和准确性；最后，采用更先进的 检测方法和技术，如色谱法、质谱法等，以提高实验结果的准确性和可靠性。
PART 07
参考文献
数据处理
根据标准品溶液的浓度和光密 度值绘制标准曲线，并计算待
测样本中AKP的浓度。
AKP的活性检测步骤与方法
准备试剂和设备
01 根据实验要求准备所需的试剂
和设备，如底物、终止液、分 光光度计等。
配置反应体系
02 将底物溶解在适当的缓冲液中
，加入待测样本，设置空白对 照。
启动反应
03 将反应体系在恒温条件下孵育
进行AKP的浓度和活性检测。
PART 02
实验原理
REPORTING
WENKU DESIGN
AKP的浓度测定原理
酶联免疫吸附法（ELISA）
利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶与底物反应的显色反应，测定AKP的浓 度。
分光光度法
利用特定波长下的吸光度值与AKP浓度的线性关系，通过测定吸光度值计算 AKP的浓度。
掌握AKP的浓度测定 与活性检测方法
碱性磷酸酶的提取
碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。
由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。
3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。
唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。
二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
AKP说明书
碱性磷酸酶 (U / gprot)
=
测定管吸光度 标准管吸光度
×
标准管含酚的量 (0.003mg)
÷
取样量中的蛋白克数
= 0.081 × 0.003 ÷ (1.29 ×10−3 × 0.03) = 32.37U / gprot 0.194
南京建成生物工程研究所 南京建成科技有限公司
地 址： 南京市中央路 258－27 号 电 话：（025）83360321
基质液(ml)
0. 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分混匀,37℃水浴 15 分钟
显色剂(ml)
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
立即混匀,在 520nm 处,1cm 光径,0 管调零,测各管 OD 值
以所测得的吸光度为纵坐标，以相应的标准浓度单位为横坐标，绘制标准曲线。
×
100ml 0.05ml
= 0.404 × 0.005 × 100 = 16.16金氏单位 /100ml
0.250
0.05
1
本试剂盒仅用于科研、实验室
南京建成
（二）、组织匀浆中 AKP 的测定：
1、 操作表：
测定管
标准管
空白管
1%组织匀浆(ml)
0.03
0.1mg/ml 酚标准液(ml)
三、操作：
Байду номын сангаас
(一)、血清（浆）中 AKP 的测定： 1、操作表：
测定管
标准管
空白管
血
清（ml）
0.05
0.1mg/ml 酚标准应用液（ml）
0.05
双 蒸 水（ml）
0.05
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Zn2
Asp-369、Asp-51的羧基 的其中一个氧 His-370的咪唑氮 H2O 磷酸酯的氧原子
Mg
Asp-51的另一个氧 Thr-155、Glu-322羧 基上的一个氧原子 三个水分子
与Mg配位的OH-，使Ser 去质子化，则Ser的氧 原子有更强的亲核性
AP的生理及研究作用
①可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分
泌及骨化过程中发挥了重要作用 ②在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性内切 酶切割后的载体DNA，去除载体DNA两末端的5′-磷 酸残基，以防止载体DNA自我环化，从而提高其重
组效率 。
谢谢
金属离子的作用
②酶与底物以金 属离子Zn为桥接 点，金属将底物 磷酸引导到正确 的位置（Ser-活 性部位），使酶 促反应顺利进行。
金属离子的作用
③金属Zn1中和
离去基团的负电
荷，是RO―能
够顺利离去。
金属离子的作用
④Mg定位了水
分子，催化Ser-
102的质子化和
去质子化的反应。
金属离子的作用
Zn1原子配位的氢氧根离 子进攻磷酸基，形成POH键，最终形成无机磷 酸盐与底物的非共价结 合形式。
Mg配位的水分子现在 作为一个质子酸，将 一个质子给Ser-102， 则P-Ser键断裂
金属离 Lewis酸的作用， 极化底物，使之 成为一个良好的 亲电试剂。
催化机理
H2O取代无机磷酸， 完成催化反应
底物磷酸酯嵌 其它的磷酸的氧原子则与Arg-166 中间体的磷原子 入酶的结合部 的胍基形成氢键 断裂P-OR 键 位，磷酸酯的 两个氧原子分 别与Zn1和Zn2 配位，形成两 个Zn原子之间 的磷酸盐桥
去质子化的 磷酸酯被绑定 Ser进攻磷原 子，从而导致 到Ser-102中的 Ser-残基的 磷酸化，并形成共价 活性位点 Ser磷酸盐中间体(仍然与Zn 配位)
碱性磷酸酶（ALP）
功能
结构
催化机理
金属离子的作用
碱性磷酸酶（ALP）
功能：将底物分子(核酸、蛋白质、生物碱)上的磷酸
基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。
一般用于催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA 或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。 来自肝脏：ALP1、ALP2、ALP6
①锌离子在碱性磷酸酶中有广义Lewis酸的作用，极化底 物，使之成为一个良好的亲电试剂。 ②酶与底物以金属离子Zn为桥接点，金属将底物磷酸引
导到正确的位置（Ser-活性部位），使酶促反应顺利进行。
③金属Zn1中和离去基团的负电荷，是RO-能够顺利离去。 ④Mg定位了水分子，催化Ser-102的质子化和去质子化的 反应。
同 工 酶
来自骨细胞：ALP3
来自胎盘及癌细胞：ALP4
来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞：ALP5
结 构
二聚体蛋白 中央：10层β-折叠；两侧：15个 不等的α-螺旋； 顶部：单一的α-螺旋、三层β-折叠。 每个亚基含499个AA，均具有一个活性中心 酶中心有一个空腔口袋，用于与磷酸酯结合。
配位环境 Zn1