SSR标记的原理步骤
SSR技术原理,方法及步骤
SSR技术1. SSR简介说明：简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类：根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：1）完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT；2）不完全型(imperfect)，指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT；3）复合型(compound) ，指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 。
ssr分子标记原理
ssr分子标记原理SSR分子标记原理引言：SSR分子标记（SSR molecular tagging）是一种用于分析和鉴定生物体内特定分子的技术。
它基于分子生物学和生物化学的原理，通过特定的标记物，可以在细胞、组织或体液中准确地检测和定位目标分子。
本文将介绍SSR分子标记的原理及其在科研和医学领域的应用。
一、SSR分子标记的原理SSR分子标记是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术。
它利用了DNA序列中的简单重复序列（simple sequence repeat, SSR），即由1-6个碱基重复组成的核酸序列。
SSR序列在基因组中广泛存在，具有高度变异性和遗传稳定性，因此可以作为DNA分子标记的候选序列。
SSR分子标记的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. DNA提取：从样品（如细胞、组织或体液）中提取总DNA。
2. SSR标记物设计：根据目标分子的序列信息，设计特异性引物，引物的两端分别包含互补的SSR序列。
3. PCR扩增：利用PCR技术，使用设计好的引物对DNA进行扩增，扩增产物中包含了目标分子的序列和SSR序列。
4. 电泳分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，根据SSR序列的长度变异性，可以将不同样品中的目标分子进行定性和定量分析。
二、SSR分子标记的应用SSR分子标记技术在科研和医学领域具有广泛的应用价值，以下是几个典型的应用案例：1. 遗传多样性研究：SSR分子标记可以用于研究不同物种或不同个体间的遗传多样性。
通过对多个基因座进行SSR分子标记，可以获得物种或个体的遗传背景信息，进而推断种群结构、基因流动和进化关系等。
2. 基因定位和图谱构建：SSR分子标记可以用于构建遗传图谱，帮助研究人员定位和克隆感兴趣的基因。
通过SSR标记物在遗传图谱上的位置，可以确定目标基因的大致区域，为后续的克隆工作提供有力的指导。
3. 疾病诊断和预后评估：SSR分子标记在医学诊断中的应用也日益广泛。
通过对特定基因的SSR序列进行分子标记，可以检测和鉴定与疾病相关的突变或多态性。
SSR分析的原理及操作技术
▪ 银染法（硝酸银）：是一种检测微量DNA的理想方法。
优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永 久保存
原理：银染液中的银离子(Ag+)可与DNA形成稳定的复合物，然后 用还原剂如甲醛在碱性条件下使Ag+还原成银颗粒，可把DNA 电泳带染色成黑褐色
7.染色
步骤 漂洗30s 染色8min 漂洗30s
显色4min
漂洗
试剂 ddH2O 0.1％硝酸银400ml ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四 硼酸钠定容至500ml ddH2O
8.观察
▪ 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide）
甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide）
100ml 38g 2g
5.电泳样品的准备：在PCR产物中加入8µL的loading buffer混合，得 到混合物，95℃加热3min，迅速置于冰上冷却，然后点样。
Loadingbuffer组分
▪ 这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂 的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶
▪ 变性聚丙烯酰胺凝胶
用于单链DNA片断的分离与纯化。这些凝胶在尿素或甲酰胺等抑制核 酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合。变性的DNA在这些凝胶中的迁 移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。
▪ 非变性聚丙烯酰胺凝胶
用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶 中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比。然而，电泳迁移率也受 其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNA的迁移率 可相差10％。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的DNA片段 和检测蛋白质－DNA复合物。
ssr标记的原理及应用
SSR标记的原理及应用1. 什么是SSR标记？SSR标记（Server Side Rendering，服务器端渲染）是一种将动态生成的内容直接嵌入到HTML页面中的技术。
传统的JavaScript渲染技术（如SPA单页面应用）需要在浏览器中使用JS代码动态生成页面内容，而SSR标记则在服务器端将动态内容生成后，将其直接嵌入到HTML页面中，再传输给浏览器进行展示。
2. SSR标记的原理SSR标记的原理主要分为以下几个步骤：•接收客户端请求：服务器通过监听HTTP请求，获取客户端请求的URL。
•路由解析：服务器根据URL进行路由解析，确定请求的页面和相应的数据。
•数据获取：服务器从数据库或其他数据源获取相应的数据。
•模板渲染：服务器使用模板引擎将数据填充到HTML模板中，并生成标记好动态内容的HTML页面。
•HTML页面发送：服务器将生成的HTML页面发送给客户端。
•客户端渲染：浏览器接收到HTML页面后，在展示页面之前，会解析其中包含的JavaScript文件并执行，以完成页面的交互和渲染。
3. SSR标记的优势相比于传统的客户端渲染，SSR标记具有以下几个优势：•更快的首次加载速度：SSR标记在服务器端生成带有动态内容的HTML页面，因此用户第一次请求页面时可以直接获取到完整的页面内容，无需等待JavaScript文件的加载和执行。
这可以显著减少首次加载的时间，提高用户体验。
•更好的SEO效果：由于SSR标记在服务器端生成静态HTML页面，搜索引擎爬虫可以直接读取页面内容，获取更多的有效信息，从而提高网页的收录率和排名。
•更低的服务器负载：SSR标记将页面的渲染工作放在了服务器端，相比于传统的客户端渲染，可以减轻浏览器的压力，降低服务器负载。
4. SSR标记的应用场景SSR标记在以下几个场景中具有广泛的应用：•需要更好SEO效果的网站：对于需要被搜索引擎爬虫收录的网站，使用SSR标记可以提高网站的可见性和排名，增加自然流量。
SSR分子标记
SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
SSR分子标记的步骤
第一步：DNA 提取： 第二步：PCR :
PCR体系（15微升）：45纳克模板DNA 2.25微摩尔/升引物 11.5毫摩尔/升 氯化镁 各625微摩尔/升 4种dNTP 10X PCR缓冲液 1.5U Taq DNA 聚合酶 PCR反应程序 ： 变性94 摄氏度 3min 30次循环：94摄氏度 25s ，50-60摄氏度 25s ，72摄氏度 45s 最后72摄氏度延伸 10min
根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR， 电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多 态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成 功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析， 从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调 控和差异。
SSR标记原理示意图
SSR分子标记的优势
SSR标记
SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内 在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术
SSR分子标记的分子学基础
微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰 富，而且常常是随机分布于核DNA中。在植 物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的 研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分 布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫 星出现的频率变化是非常大的 常见的二核苷酸重复单位：（AC)n、 （GA)n、（AT)n 常见的三核苷酸重复单位： （AAG)n、 （AAT)n
玉米品种鉴定技术规程 ssr标记法
玉米品种鉴定技术规程 ssr标记法SSR（Simple Sequence Repeat）标记法是一种用于玉米品种鉴定的技术规程。
以下是关于玉米品种鉴定技术规程 SSR 标记法的一些基本信息：1. SSR 标记的原理：SSR 标记是基于短小简单重复序列的分子标记技术。
这些重复序列在基因组中广泛存在且具有高度多态性。
通过设计特定的引物，可以扩增并检测这些 SSR 标记，从而识别不同品种之间的差异。
2. DNA 提取：从待鉴定的玉米样本中提取高质量的 DNA 是进行 SSR 分析的重要步骤。
通常使用适当的 DNA 提取方法，如 CTAB 法或商业试剂盒。
3. SSR 引物设计：针对玉米基因组中的 SSR 位点，设计特异性的引物对。
这些引物可以根据已发表的玉米 SSR 数据库或通过自行开发来获得。
4. PCR 扩增：使用设计的 SSR 引物对，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。
PCR 反应条件可以根据引物的特性和设备要求进行优化。
5. 电泳和凝胶分析：扩增产物通过电泳在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。
根据 SSR 标记的大小差异，可以观察到不同的电泳条带。
6. 数据分析：对电泳结果进行分析，记录每个品种的 SSR 标记图谱。
通过比较不同品种之间的图谱差异，可以鉴定出品种的独特特征。
7. 品种鉴定：根据 SSR 标记的多态性和品种特有的图谱模式，可以对玉米品种进行准确的鉴定和区分。
需要注意的是，SSR 标记法需要专业的实验室设备和技术操作，同时也需要对玉米基因组和 SSR 标记的相关知识有一定的了解。
在进行品种鉴定时，建议遵循相关的标准操作程序和实验室安全规范。
SSR分析的原理及操作技术报告
以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术： 单核苷酸多态性（SNP）
SSR简介
在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，
根据重复序列在基因组中的分布形式可分为： 串联重复序列（Tandemly repeated sequences） 分散重复序列（Interspersed repeated sequences） 依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联 重复序列分为： 卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp；
和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引 物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。
SSR标记的基本原理
由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩
增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态 性称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的 一对等位基因。
0.1％硝酸银400ml
ddH2O 8g NaOH，2ml 37％甲醛，0.1g四硼 酸钠定容至500ml
漂洗
ddH2O
8.观察 记录父母本及F1代的带型，供进一步的 分析用。
4.制备5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：
将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.0％的琼脂糖封口，将配好
的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳 子，静置1h，让其聚合凝固。
5％变性胶 尿素 （Urea） 5×TBE buffer 40％丙稀酰胺 10％过硫酸铵 TEMED 40％丙稀酰胺溶液（19：1） 丙稀酰胺（Acrylamide） 甲义-丙稀酰胺（Bis-Acrylamide） 100ml 42g 20ml 12.5ml 400µl 87.5µl 100ml 38g 2g
SSR分子标记剖析
三、实验用品
1. 仪器设备与耗材：PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、 微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心 管、PCR管、移液器枪头等 2. 试剂 ① 提取缓冲液：100mmol/L Tris· Cl，20mmol/L EDTA ，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。 ② 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。
引物 设计
二
使用,筛选SSR位点
5'锚定PCR 分离SSR标记
K可以跟任何核苷酸配对，V不 能与A配对，R不能与G配对， 其他核苷酸均可与它们配对。 这样，VRVRV五个碱基一起 构成了一个封闭碱基群。在 PCR过程中，由于VRVRV不 能与GA配对，该引物与模板 DNA结合的时候，就不会在 (GA)n重复区滑动，只会结合 在如图1所示的位置上，以保 证SSR位点的长度多态性不会 丢失。
SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
2. SSR分子标记的步骤
第一步：基因组DNA 提取 第二步：PCR 第三步：扩增产物电泳检测 第四步：结果分析
微卫星分子标记对18份基因型的扩增结果
3. SSR分子标记引物设计
一
从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查 询
之用。
2. DNA提取
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ 将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约0.1g放入1.5ml离心管中，立 即加入0.5ml提取缓冲液（60℃水浴预热），摇动混匀。 60℃水浴保温30~60min（时间长，DNA产量高），不时摇动。 加入0.5ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀，室温下静 置5~10 min，使水相和有机相分层。 室温下12000rpm离心5 min。 小心移取上清液至另一1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放 置片刻即出现絮状DNA沉淀。 室温下12000rpm离心5 min，去除上清液，再加入100μl TE溶解沉淀。 加入1/10体积（约10μl）的3mol/L NaAc及二倍体积（约300μl）预冷的无 水乙醇，混匀，-20℃放置20 min左右。 室温下12000rpm离心5 min。 去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入100μl TE溶解，-20℃贮存,备用。
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SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。
研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。
如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；
(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。
但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。
由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。
操作步骤
1、在25μl反应体系中，加入
模板DNA 1μl（20ng）；
SSR引物1μl（0.15μM）
10×PCR缓冲液2.5μl
MgCl2 2μl (25mM)
dNTP 2μl (0.2mM)
Tap 酶1单位
加ddH2O至25μl
2、反应在PE 9600热循环仪上进行。
PCR反应先95℃变性4min,接着94℃45s、55℃30s 和72℃60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min。
PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离。
点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压1500V,时间约2～3h。
DNA染色采用银染法。
电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染色、显影、固定等步骤染色。
电泳和银染具体操作与AFLP相似。
3、数据分析：
用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA 提取
将来自每份参试资源20 个随机选取单株100～150 mg 左右的叶样，在液氮中冻干研磨成细粉。
参照Dellaporta等和Doyla等创立的CTAB法，提取DNA。
提取到的基因组总DNA，采用1.4%琼脂胶电泳，溴化乙锭（EtBr）显影，以已知浓度的λDNA 做对照，稀释标定到25 ng·µl-1，放－20℃冰箱备用。
1.2.2 SSR 反应条件
PCR 反应总体积为10 µl，反应体系中含1×PCR Buffer，2.5 mmol·µl-1MgCl2，4种dNTP 各0.168 mmol·µl-1，0.5U Taq DNA polymersae酶，Primer F 和Primer R 引物各0.4 µmol·µl-1，25 ng模板DNA。
反应在PTC-220 型PCR 扩增仪（MJResearch，Inc.）上进行。
反应程序为：盖温控制在105℃，94℃预变性3 min，随后进行以下38 个循环：94℃变性30 s，复性30 s （温度依引物的退火温度而定），72℃延伸2 min，最后72℃延伸5.5 min。
1.2.3 产物检测
扩增产物加1/5体积的上样缓冲液（40%蔗糖，0.025%溴酚蓝），取3.5 µl，利用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测[27]。
1.2.4 数据分析
记载同一对SSR引物扩增条带（等位变异）在各参试资源中有或无。
如果无，记为0；如果有，则按其分子量从大到小的顺序，分别记录为1、2、3、……。
此种转换方式是根据SSR 标记长于揭示等位基因的特点，配合相应统计软件对SSR 原始数据格式特殊要求确定的[28-30]。
不同群体间和同一群体内某一位点的等位变异数和有效等位基因数[31]、Shannon’s 信息指数[32]统计计算，在POPGENE 1.32软件包[30]中完成；资源群体遗传多样性的差异显著性比较，在FSTAT 2.9.3.2 软件包[28]中完成；参试资源间Nei78 遗传距离计算及群体间遗传距离聚类图绘制，在POPGENE 1.32 软件包[30]和MEGA 3.1 软件包[33] 中完成；参试资源间欧氏距离计算，主成分分析（PCA）及三维作图，在NTSYSpc 2.20d 软件包[29]中完成；相关系数经Microsoft Excel 计算获得。