离子交换层析 原理 步骤 详细
离子交换层析 原理 步骤 详细
※带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来 ※带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来
三、操作注意点
（一）离子交换剂的选择
原则： 根据被分离物质的性质选择—同一性 质离子交换剂中选用对被分离物质各组 分之间结合力差异大的型号交换剂
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素
三、结果要求：
指出2个洗脱峰分别出现在几号管？
分别是哪个氨基酸？
弱酸型 羧基 阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱
叔胺、仲胺、伯胺基团
（4）离子交换树脂对离子的亲和力 ■ 离子取代顺序：
电荷高者
离子大者 浓度大者
++ +
+ + + + ++ + + + + + +
> > >
+ + +
（4）离子交换树脂对离子的亲和力
①阳离子树脂 + ++ +++<Ti++++ 电价数：Na <Ca <Al 原子价数相同，原子序数 Li+<Na+<K+<Pb+ ②阴离子 强碱性交换树脂 CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I<C2O4=<SO4= 弱碱性交换树脂 F-< CL-< Br-= I- =CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根< 柠檬酸根<C2O4=<SO4=<OH
离子交换层析原理步骤详细
离子交换层析原理步骤详细离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 是一种常见的分离和纯化技术，广泛应用于生物科学、医药、环境和化学工业等领域。
本文将详细介绍离子交换层析的原理和步骤，并提供相关操作注意事项。
原理离子交换层析是基于离子交换剂与待分离物中的离子之间的相互作用来实现分离纯化的。
离子交换剂通常是一种带有功能基团的固体材料，如离子交换树脂。
当待分离物溶液通过离子交换层析柱时，待分离物中的离子与离子交换剂上的功能基团发生相互作用，使得不同离子具有不同的保留时间，进而实现分离纯化。
离子交换层析可以通过两种模式进行操作：阳离子交换和阴离子交换。
在阳离子交换中，离子交换剂具有负电荷的功能基团，可以吸附带有正电荷的离子，而排斥带有负电荷的离子。
在阴离子交换中，离子交换剂具有正电荷的功能基团，可以吸附带有负电荷的离子，而排斥带有正电荷的离子。
步骤离子交换层析通常包括以下几个步骤：1. 样品预处理在进行离子交换层析之前，需要对待分离样品进行预处理。
这包括将待分离物从其他成分中纯化或富集，并调整其pH值和离子浓度。
2. 选择合适的离子交换剂根据待分离物中的离子类型和性质，选择合适的离子交换剂。
如果待分离物中的离子是带正电荷的，则选择阴离子交换剂；如果待分离物中的离子是带负电荷的，则选择阳离子交换剂。
此外，还需要考虑离子交换剂的大小、形状、孔径和稳定性等因素。
3. 准备离子交换柱将选择的离子交换剂装填到离子交换柱中。
通常，离子交换剂以干燥的形式存在，因此在装填离子交换柱之前需将其充分湿润或反应活化。
4. 样品加载将经过预处理的待分离样品加载到离子交换柱中。
样品溶液会在离子交换柱中与交换剂的功能基团发生相互作用，从而实现分离纯化。
5. 洗脱通过改变洗脱缓冲液的条件，如改变pH值或离子浓度，来洗脱已经吸附在离子交换柱上的离子。
洗脱的条件需要根据待分离物和交换剂之间的相互作用来进行调节。
药师考试辅导：离子交换层析法
离⼦交换层析(ionexchangechromatography)是利⽤离⼦交换剂上的可交换离⼦与周围介质中被分离的各种离⼦间的亲和⼒不同，经过交换平衡达到分离的⽬的的⼀种柱层析法。
该法可以同时分析多种离⼦化合物，具有灵敏度⾼，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常⽤的层析法之⼀。
(⼀)基本原理离⼦交换层析对物质的分离通常是在⼀根充填有离⼦交换剂的玻璃管中进⾏的。
离⼦交换剂为⼈⼯合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷不同，可分为阴离⼦交换剂和阳离⼦交换剂。
含有欲被分离的离⼦的溶液通过离⼦交换柱时，各种离⼦即与离⼦交换剂上的荷电部位竞争性结合。
任何离⼦通过柱时的移动速率决定于与离⼦交换剂的亲和⼒、电离程度和溶液中各种竞争性离⼦的性质和浓度。
离⼦交换剂是由基质、荷电基团和反离⼦构成，在⽔中呈不溶解状态，能释放出反离⼦。
同时它与溶液中的其他离⼦或离⼦化合物相互结合，结合后不改变本⾝和被结合离⼦或离⼦化合物的理化性质。
离⼦交换剂与⽔溶液中离⼦或离⼦化合物所进⾏的离⼦交换反应是可逆的。
假定以RA代表阳离⼦交换剂，在溶液中解离出来的阳离⼦A+与溶液中的阳离⼦B+可发⽣可逆的交换反应，反应式如下：RA+B+ RB+A+该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作⽤定律。
离⼦交换剂对溶液中不同离⼦具有不同的结合⼒，结合⼒的⼤⼩取决于离⼦交换剂的选择性。
离⼦交换剂的选择性可⽤其反应的平衡常数K表⽰：K＝[RB][A+]/[RA][B+]。
如果反应溶液中[A+]等于[B+]，则K＝[RB]/[RA]。
若K>I，即[RB]>[RA]，表⽰离⼦交换剂对B+的结合⼒⼤于A+；若K=1，即[RB]＝[RA]，表⽰离⼦交换剂对A+和B+的结合⼒相同；若K<1，即[RB]<[RA]，表⽰离⼦交换剂对B+的结合⼒⼩于A+。
K值是反映离⼦交换剂对不同离⼦的结合⼒或选择性参数，故称K值为离⼦交换剂对A+和B+的选择系数。
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换柱层析及其原理
离子交换柱层析及其原理离子交换层析介质的应用离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。
子交换层析(Ion Exchange Chromatography 简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
1.离子交换层析的基本原理:离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。
几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。
目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。
2.离子交换层析介质:离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。
离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。
离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。
1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。
几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。
目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。
2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。
平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。
平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换层析法的原理
离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。
该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。
离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。
通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。
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苯乙烯 母体
二乙烯苯 交联剂
聚苯乙烯
聚丙烯酸—阳离子交换树脂
甲基丙烯酸
二乙烯苯
特点：高交换量 p质
①、一般离子交换剂的特性
• 多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内 • 不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂 • 稳定性： • 离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团 ②、交换量：指交换剂中可交换的离子数
弱酸型 羧基 阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱
叔胺、仲胺、伯胺基团
（4）离子交换树脂对离子的亲和力 ■ 离子取代顺序：
电荷高者
离子大者 浓度大者
++ +
+ + + + ++ + + + + + +
> > >
+ + +
（4）离子交换树脂对离子的亲和力
①阳离子树脂 + ++ +++<Ti++++ 电价数：Na <Ca <Al 原子价数相同，原子序数 Li+<Na+<K+<Pb+ ②阴离子 强碱性交换树脂 CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I<C2O4=<SO4= 弱碱性交换树脂 F-< CL-< Br-= I- =CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根< 柠檬酸根<C2O4=<SO4=<OH
2.离子交换纤维素
阴离子交换纤维素 —DEAE-纤维素 pH8.6 以下分离中性或酸性物质 , 具二乙 胺乙基阳离子交换纤维素
—CM-纤维素 一般pH>4条件下使用,具有羧甲基
3.离子交换凝胶—分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex） 聚丙烯酰胺（PAG） 琼脂糖（Sepharose）
操作过程： 1.装柱 2.离子交换 3.洗脱
三、结果要求：
指出2个洗脱峰分别出现在几号管？
分别是哪个氨基酸？
与树脂结合力
胶体
洗脱
二、离子交换剂的类型
胶 体
在惰性载体上引入带有电荷的活性基团 （一）按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 胶 —— 带负电荷，与阳离子交换 体 阴离子交换剂 ——带正电荷，与阴离子交换 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如 阳离子交换树脂稳定。
（二）按载体种类不同
1.离子交换树脂： (1)类型 聚苯乙烯树脂：
四、应用
分离多肽蛋白、氨基酸、核酸 及其他带电的生物分子
实验：
离子交换层析分离氨基酸
一、原理：
pI 9.7 Mr 147 pI 2.97 Mr 133
pH
4.2
++
※Dowex50阳离子交换树脂
一、操作注意点：
1、装柱和加样同凝胶层析 2、洗脱液（NaOH和柠檬酸）别混淆 3、控制流速：20滴/min
离子交换层析
ion exchange chromatography
一、原理
离子交换层析是用离子交换剂（具 有离子交换性能的物质）作固定相，利 用它与流动相中的某种离子进行可逆的 交换性质来分离子型混合物的层析方法
去吸附
分离结束 高 盐
低 盐
不同蛋白质在特定pH值下有不同带电特性
带电荷
离子交换树脂如何分离蛋白质
③ 、交联度： 合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占 的百分比
苯 乙 烯 + 二 乙 烯 苯 聚 苯 乙 烯 （单体） （交联剂） 二乙烯苯 交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯
交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少
交联度越小 树脂的网孔越大 膨胀性大 交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损
根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在碱性范围内使用 弱碱型—只能在酸性范围内使用
3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量
（二）缓冲液的选择
原则： 不能发生化学反应，避免使样品变性
(三)洗脱剂
原则： 所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离 子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱
目数： 离子交换树脂的颗粒直径大小
Dowex50 为20-50目 Dowex 100 149m Dowex 50 297m Dowex 20 840m 目数越大表示直径越小
（3）可引入的解离基团
阳离子交换树脂 强酸型 磺酸基 中等酸型 磷酸根 -SO3-H+ -O-PO2H2 亚磷酸根 -O-POH2 -COOH
※带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来 ※带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来
三、操作注意点
（一）离子交换剂的选择
原则： 根据被分离物质的性质选择—同一性 质离子交换剂中选用对被分离物质各组 分之间结合力差异大的型号交换剂
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素