挥发性脂肪酸VFA测定步骤与方法

挥发性脂肪酸的测定

一、GC（Gas chromatograph）工作条件

仪器：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司）

毛细柱：NUKOLTM Capillary Column ( Supelco )；Column No.34292-07B

30m×0.32mm×0.25μm film thickness

气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130℃，汽化温度180℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为氮气，压力为60 KPa，氢气压力为50 KPa，氧气压力50 KPa，灵敏度（档）为101，衰减 3.0

二、样品制备

1．试剂制备

（1）配制25%w/v 的偏磷酸溶液，将25g偏磷酸溶在100mL双蒸水中

（2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸，定容到100mL。（可先用80 ml双蒸水，加热溶解偏磷酸，然后定容至100 ml）

（3）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100 g、丙酸0.3700 g、丁酸0.1765 g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100 mL。

2．样品制备

(1) 发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定1ml样品到离心管中，再加入0.2 ml的偏磷酸巴豆酸混合溶液，－20℃冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心5min，取上清液保存，测定前再12000rpm离心5min(或少许通过0.22μm针式滤器，滤液直接进样用 1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2－1.0μL。

(2) 食糜及粪样VFA测定取1g置于离心管中，加入5－10倍的双蒸水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。

3．保留时间的确定

与样品处理相同，在 1 ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。

4．有机酸浓度的计算

通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或浓度）与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。

（样品某酸峰面积值×巴豆酸标样峰面积×某酸标样浓度）某酸浓度(mM)＝

（样品中巴豆酸面积值×标样某酸峰面积）

5．有机酸重现率

将某有机酸（如乙酸）连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。

乙酸重现率变异系数： 1.2872±0.06404

丙酸重现率变异系数：0.5104±0.01961

丁酸重现率变异系数：0.3422 ±0.01037

异丁酸重现率变异系数：0.4668±0.01447

戊酸重现率变异系数：0.1431±0.01754

异戊酸重现率变异系数：0.1671±0.03496

6. 不同标样有机酸的GC 峰形

巴豆酸

丙酸

戊酸

异戊酸

混合标样 样品

标样的分子量和出峰时间

气相色谱的气体工作条件（VFA 测定）

乙酸 丙酸 异丁酸

丁酸

异戊酸

戊酸

巴豆酸

消化道微生物研究室南京农业大学动物科技学院

2007.9.28