葡萄球菌属检验
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Revised as of 23 November 2020金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
葡萄球菌属鉴定
敏感：抑菌圈直径≥16mm 耐药： 抑菌圈直径<16mm
医学检验学院
讨论:
做触酶试验时应注意哪些问题。
试述血浆凝固酶试验的原理、检测方法和用 途。 试述金黄色葡萄球菌的主要鉴定依据。 如何鉴定致病性葡萄球菌。
10
医学检验学院
葡萄球菌属鉴定
实验目的
掌握葡萄球菌的鉴定方法 熟悉葡萄球菌的菌落特点 熟悉葡萄球菌的菌体形态
医学检验学院
1. 菌种
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌
2. 试剂（1）革兰染色液 （2） 3％H2O2（临用时现配）、新鲜兔血浆 （或人血浆）
医学检验学院
3
操作步骤
1、形态观察
＋
（1）触酶试验原理：葡萄球菌属均可产生触酶 触酶
2[O]
触酶
取菌
医学检验学院
（2）血浆凝固酶试验原理：病原性葡萄球菌产生 血浆纤维蛋白原 方法：
生理盐水 血浆
血浆凝固酶
纤维蛋白
取待检菌混匀
医学检验学院
（3）新生霉素敏感试验 待检菌涂布
5¼ g/片 新生霉素纸片 35℃，16h～20h
观察抑菌圈大小
医学检验学院
取菌 NS
革兰染色
革兰阳性球菌， 散在或呈不规则葡萄状排列。
镜检
2、菌落观察 待检菌划Fra bibliotek接种医学检验学院
血琼脂平板
普通琼脂平板
35℃ 培养1 8h～2 4h
观察菌落
（各三块）
3．生化反应 H2O2 2[O]
方法：
3%H2O2
1 2 3 4 1 2 3 4
30”
医学检验学院 H2O O2 (产生气泡）
2011实验4葡萄球菌属的检验
实验一葡萄球菌属的检验金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)在食品污染病例中占据十分重要的位置，同时也是医院临床感染导致肺炎及伤口感染的主要病原菌，占医院感染病例的l0％；而抗生素的广泛应用导致了耐药菌株尤其是耐甲氧西林葡萄球菌的大量出现，使其成为与艾滋病、乙型肝炎并列的世界三大感染顽疾。
因此对金葡菌的检测研究一直以来备受重视，其研究方向主要集中在两个方面：耐甲氧西林金葡菌的检测及产致病性毒素金葡菌的检测。
传统的检测方法先做选择性培养，然后做鉴定试验，包括血浆凝固酶试验、免疫学试验、耐热核酸酶活性试验及各种糖、醇发酵试验及新生霉素敏感试验等，其优点是操作简便，所需设备简单，但一般都存在耗时长、灵敏性差等缺点，且Baird-Parker选择性培养时无法识别受热处理而损伤的菌体；凝固酶试验及耐热核酸酶试验与传统的经典方法有很好的对应性，但一些凝固酶及耐热核酸酶阴性菌同样可以产生致病性毒素，或其他少数葡萄球菌也可以产生耐热核酸酶或相似酶而导致假阳性，一定程度上限制了酶活性检测的应用；成品凝集检测试剂盒虽有很好的特异性，但在实际样品的检测时灵敏性差异明显，且成本较高。
随着分子生物学技术的广泛应用，对金葡菌的检测也从传统方法过渡到以PCR及杂交探针、基因芯片为主的现代技术手段，从基因水平更准确、灵敏地检测病原菌的存在。
表4-1-1 三种葡萄球菌的主要性状和生化反应表4-1-2 葡萄球菌属常用试验的用途【实验目的】1. 熟悉葡萄球菌的形态、染色及培养特征。
2. 掌握葡萄球菌血浆凝固酶试验的原理、方法和临床意义。
3. 了解葡萄球菌肠毒素的测定。
【实验器材和材料】1. 菌种金黄色葡萄球菌A TCC25923、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌液体培养物（接种用、新生霉素试验用、肠毒素试验用）、沸水浴加热灭活的三种菌液1滴/组（耐热核酸酶试验用）2. 培养基普通琼脂平板、血琼脂平板、甘露醇发酵管甲苯胺蓝核酸琼脂、10g/L盐水琼脂、液体培养基（肠毒素试验用）3. 试剂新鲜兔血浆或人血浆、3%H2O2、致敏胶乳试剂、新生霉素纸片、生理盐水、载玻片、小试管、革兰染色液、肠毒素血清、标准抗毒素血清4. 接种环、打孔器、尺子5. 沸水浴6. 投影仪【方法和步骤】1. 划线接种：用接种环将三种葡萄球菌分别划线接种普通平板和血琼脂平板。
葡萄球菌属检验
1．概述葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。
金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。
2. 标本类型血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。
3.2 培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的?溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。
在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。
表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。
3.3 生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。
金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。
3.4.2 与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。
链球菌属葡触酶试验阳性，试验为发酵型，O/F葡萄球菌属与链球菌属的鉴别3.4.3萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。
3.4.4 凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。
表1 凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验半乳糖海藻凝固硝酸溶血菌名触酶苷酶糖酶盐金黄色葡萄球菌金黄色亚-+++++种金黄色葡萄球菌厌氧亚种+-+---施氏葡萄球菌聚集亚种++++-ND中间葡萄球菌++d+++海豚葡萄球菌++++-NDS.lutrae++++++猪葡萄球菌d+-++-注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
微生物学检验葡萄球菌属PPT课件
2020/7/22
致病物质
• 凝固酶 • 葡萄球菌溶素 • 杀白细胞素 • 肠毒素 • 剥脱毒素 • 毒性休克综合征毒素－1
2020/7/22
凝固酶
• 游离凝固酶：采用试管法检测
协同因子
游离凝固酶
凝血酶
纤维蛋白原
纤维蛋白
血浆凝固
• 结合凝固酶：采用玻片法检测
报告
检验方法—直接镜检
• 方法:取标本直接涂片,革兰染色后镜检 • 初步报告:
“查见革兰阳性葡萄串状排列球菌，疑 似葡萄球菌” “查见革兰阳性球菌”
2020/7/22
检验方法—分离培养
• 脓、痰、脑脊液标本－→接种血平板 • 菌落特征：光滑型、中等大小、脂溶性
色素、透明溶血环（β-溶血环）
2020/7/22
2020/7/22
葡萄球菌传统分类
产生溶血毒素
金黄色 葡萄球菌
+
表皮 葡萄球菌
－
腐生 葡萄球菌
－
产生凝固酶
+
－
－
产生耐热DNA酶
+
－
－
产生SPA
+
－
－
新生霉素敏感性
S
S
R
致病性
强
弱
无
2020/7/22
金葡菌噬菌体分型
• 分型：分五个群，共22型 • 意义：追踪传染源
2020/7/22
抵抗力
• 是抵抗力最强的无芽孢细菌 • 耐干燥 • 对龙胆紫敏感 • 易形成耐药性：耐甲氧西林金黄色葡萄
2020/7/22
抗原构造
★葡萄球菌A蛋白（SPA） • 存在于金黄色葡萄球菌细胞壁 • 可与人和其它哺乳动物IgGFc段非特异性
实验 葡萄球菌属和链球
（一）菌落特点、菌体形态及染色性
1.葡萄球菌
金黄色葡萄球菌
2.链球菌
肺炎链球菌
3.肠球菌
三步骤和方法
革兰氏阳 性球菌鉴 定流程
1 触酶 2 O/F 3胆盐溶菌
4凝固酶
5新生霉素
6杆菌肽
7CAMP 四
（二）鉴定相关试验
1.触酶试验
2.凝固酶试验
3.甘露醇发酵试验
原理：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸， 使培养基由紫色变为黄色。
4.新生霉素敏感性
5. Optochin敏感试验
原理： Optochin可抑制肺炎链球菌的生长。 结果判定：抑菌圈直径≥14mm为阳性。反 之阴性。
6. 胆汁七叶苷实验
方法：待测菌接种胆汁-七叶苷琼脂培养基， 35度孵育18-24h。 结果：细菌生长，培养基变黑色为阳性，不变 色为阴性。
实验 葡萄球菌属、链球菌属 和肠球菌属的培养和鉴定
临床病原生物学教研室
一目的要求
1. 熟悉葡萄球菌、链球菌和肠球菌的菌落 特点、菌体形态及染色性。 2. 掌握葡萄球菌、链球菌和肠球菌的分离 培养、鉴定方法和常用鉴定实验。
二器材和试剂
1.菌种 金葡、表葡、腐生，甲、乙、丙链 、肺链和肠球菌等。 2.培养基 普通培养基、血平板等。 3.试剂 3%过氧化氢、去氧胆酸钠、新鲜血 浆和细菌微量生化培养管等。 4.其他 新生霉素、杆菌肽 、Optochin纸片、 生理盐水、载玻片等。
7. 65g/LNaCL生长试验
方法：将肠球菌接种于高盐肉汤培养基中， 孵育18-24h。 结果：有细菌生长为阳性，不生长为阴性。
四注意事项
1.触酶试验不宜用血平板上的菌落，会出现 假阳性，陈旧培养物会丢失触酶活性而又出 现假阴性。因此每次试验应做阴(链球菌)阳 (金葡)对照。 2.凝固酶试验玻片法应注意控制好时间， 10S内观察结果，且必须制备浓厚的菌悬液。
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
葡萄球菌属鉴定
葡萄球菌属鉴定一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。
二、原理根据葡萄球菌的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等将葡萄球菌由属鉴定到具体种类。
三、标本不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。
四、试剂及器材革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、血浆、玻片、接种针（环）、酒精灯等。
五、鉴定程序标本涂片、染色痰、脓汁、血、脑脊液粪便、呕吐物平皿可凝菌落纯培养涂片、染色、触酶实验葡萄状（G+）、触酶（+）血浆凝固酶、葡萄糖甘露醇分解、高盐耐受实验甘露醇分解（需O2、甘露醇分解（—）厌O2均+）血浆凝固酶（+）、新生霉素（+）血浆凝固酶（—）新生霉素S R表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌六、质量控制每周进行一次葡萄球菌标准菌株的革兰氏染色、触酶、血浆凝固酶及新生霉素实验。
七、实验室解释及临床意义1、葡萄球菌广泛存在于自然界，医院内葡萄球菌的存在成为院内交叉感染的重要因素。
2、葡萄球菌是化脓性感染的重要病原菌。
3、葡萄球菌引起尿路感染的比例很大。
八、安全防护措施在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。
九、标本处理废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。
十、参考文献诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．概述
葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。
金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。
2.标本类型
血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3.鉴定
3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。
3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的 溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。
多数不溶血。
3.3
明胶、血浆凝固酶和DNA
3.4鉴别要点
试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。
表1凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验
菌名
凝固
酶
触
酶
溶
血
硝酸
盐
海藻
糖
半乳糖
苷酶
金黄色葡萄球菌金黄色亚种+ + + + + -
金黄色葡萄球菌厌氧亚种+ - + - - -
施氏葡萄球菌聚集亚种+ + + + - ND
中间葡萄球菌+ + d + + +
+ - ND
海豚葡萄球菌+ + +
S.lutrae + + + + + +
猪葡萄球菌 d + - + + -
注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。
3.5操作步骤
3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。
3.5.3凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。
3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏
参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。
5.质量控制
参见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析
6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌时应慎重。
应根据凝固酶试验进一步确认。
对可疑菌株的鉴定，
离自导管相关血流感染时，
作为优势菌时，通常被视为致病菌。
6.2甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（
某些菌对四环素中介或耐药，原
8.
[1]
指南
[2]2007
[3]2006。