葡萄球菌属鉴定
病原性球菌的检验
病原性球菌的检验一、葡萄球菌属Staphylococcus⏹广泛存在于自然界，多数是不致病的腐物寄生菌。
⏹致病性葡萄球菌可引起化脓性炎症、败血症、食物中毒等。
分类与分型1）金黄色葡萄球菌(S. aureus)：多数致病。
（2）表皮葡萄球菌(S. epidermidis)：偶可致病。
（3）腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)：不致病。
（4）致病性菌株能产生黄色或柠檬色素。
（5）多数金黄色葡萄球菌可被相应噬菌体裂解，表皮葡萄球菌不敏感。
金黄色葡萄球菌的致病性⏹用噬菌体可将金葡萄菌分为4群23个型。
⏹肠毒素型食物中毒由Ⅲ和Ⅳ群金葡萄菌引起，Ⅱ群菌对抗生素产生耐药性的速度比Ⅰ和Ⅳ群缓慢很多。
⏹造成医院感染严重流行的是Ⅰ群中的52、52A、80和81型菌株。
⏹引起疱疹性和剥脱性皮炎的菌株经常是Ⅱ群71型。
金黄色葡萄球菌的流行病学⏹作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。
因而，食品受其污染的机会很多。
金黄色葡萄球菌及其检验⏹革兰氏阳性球状，排列呈葡萄串状。
无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，个别形成荚膜。
致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）菌体较小、约0.5~1um., 普通0.4~1.2um。
培养及生化特性1.在普通培养基上生长良好（需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、pH7.4 ，对营养要求不高，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。
），在麦康凯琼脂平板不生长。
2. 血平板上生长更佳，致病菌株β溶血3. 产生金黄色色素4. 高度耐盐: 可在7.5~15%NaCl肉汤中生长。
5. 分解葡、乳、麦、蔗糖，产酸不产气，触酶阳性，致病菌株能分解甘露醇。
6. 金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶（致病因素P149）1）溶血毒素2）杀白细胞素3）血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。
4）脱氧核糖核酸酶：5）肠毒素6）溶纤维蛋白酶7）透明质酸酶抗原性1. 多糖抗原：具有群特异性，存在于细胞壁，借此可分群。
葡萄球菌属鉴定
敏感：抑菌圈直径≥16mm 耐药： 抑菌圈直径<16mm
医学检验学院
讨论:
做触酶试验时应注意哪些问题。
试述血浆凝固酶试验的原理、检测方法和用 途。 试述金黄色葡萄球菌的主要鉴定依据。 如何鉴定致病性葡萄球菌。
10
医学检验学院
葡萄球菌属鉴定
实验目的
掌握葡萄球菌的鉴定方法 熟悉葡萄球菌的菌落特点 熟悉葡萄球菌的菌体形态
医学检验学院
1. 菌种
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌
2. 试剂（1）革兰染色液 （2） 3％H2O2（临用时现配）、新鲜兔血浆 （或人血浆）
医学检验学院
3
操作步骤
1、形态观察
＋
（1）触酶试验原理：葡萄球菌属均可产生触酶 触酶
2[O]
触酶
取菌
医学检验学院
（2）血浆凝固酶试验原理：病原性葡萄球菌产生 血浆纤维蛋白原 方法：
生理盐水 血浆
血浆凝固酶
纤维蛋白
取待检菌混匀
医学检验学院
（3）新生霉素敏感试验 待检菌涂布
5¼ g/片 新生霉素纸片 35℃，16h～20h
观察抑菌圈大小
医学检验学院
取菌 NS
革兰染色
革兰阳性球菌， 散在或呈不规则葡萄状排列。
镜检
2、菌落观察 待检菌划Fra bibliotek接种医学检验学院
血琼脂平板
普通琼脂平板
35℃ 培养1 8h～2 4h
观察菌落
（各三块）
3．生化反应 H2O2 2[O]
方法：
3%H2O2
1 2 3 4 1 2 3 4
30”
医学检验学院 H2O O2 (产生气泡）
检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定
实验检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定实验目的1、认识金黄色葡萄球菌；2、学习运用PCR方法检测金黄色葡萄球菌。
实验原理金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)属于葡萄球菌属（Staphylococcus），无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。
在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。
微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的“金标准”，传统方法是进行细菌分类培养，通过生化试验、血清型、各种酶试验分析细菌的表型特点。
对牛奶中病原微生物培养需要很长时间用生化试验的方法进行种属特异性的鉴定至少需要48h以上传统的鉴定技术时间较长，从国外进口诊断试剂费用相对较高。
因此，本文建立了直接从牛奶中鉴别病原菌的PCR检测技术，这种快速、准确、有效、直接从牛奶中检测致病菌的方法将为检验检疫、食品安全质检系统以及兽医检疫提供技术支撑，从而为乳制品病原菌的检测提供一定的帮助。
建立一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法。
方法是根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物，通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCR方法。
结果是与细菌的常规分离方法相比，PCR 法敏感性高与其它型葡萄球菌无交叉反应，特异性达100%，检测细菌基因组DNA最低浓度为35ng/L（纳克每升），能在5h内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定，可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测。
所以，建立了一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法。
实验仪器、试剂与材料仪器：冰箱、摇床、显微镜、PCR反应管、PCR仪、微量加样器、高速离心官、水平电泳槽、恒压电泳仪和凝胶自动成像系统、紫外检测仪、电热恒温水浴槽。
葡萄球菌属的常规鉴定重点标准操作程序
葡萄球菌属旳常规鉴定原则操作程序1 概述葡萄球菌属是一类触媒实验阳性旳革兰阳性球菌，涉及金黄色葡萄球菌，表面葡萄球菌、腐生葡萄球菌等32个种。
是临床最常用旳化脓性球菌，广泛分布于自然界中，在人体表面鼻、咽、肠道也常常存在。
2 形态与染色革兰阳性球菌，直径0.4~1.2µm成单、双、短链或不规则状排列。
在液体培养基浓汁标本中，往往排列成双或短链状多数有鞭毛。
3 培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上典型菌落为金黄色，周边有明显旳透明（β）溶血环，部分菌落呈橙色，在高盐甘露醇平板上呈橙色菌落。
表皮葡萄球菌等其她葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，不溶血。
4 生化反映触酶实验阳性，多数能分解葡萄糖、麦蚜糖、蔗糖和甘露醇。
不分解棉籽糖和水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶实验分阳性。
5 鉴别要点5.1 本菌属特性：触酶实验阳性，革兰阳性球菌，葡萄状排列，菌落中档大小，中档干燥。
5.2 与微球菌属旳鉴别：触酶实验都为阳性，但O∕F实验葡萄球菌属为发酵型，而微球菌为氧化型或无反映，并且菌体较葡萄菌属更大，排列呈四联状为主。
5.3 与链球菌属旳鉴别：葡萄球菌属触酶实验都为阳性，而链球菌为阴性，O∕F实验葡萄球菌属为发酵型而链球菌为氧化型。
5.4 凝固酶阳性葡萄球菌旳鉴别见下表。
结合型凝游离型凝鸟氨酸脱菌名PYP实验DNA实验VP实验固酶实验固酶实验羧酶实验金黄色葡萄球菌+ + - + + -中间型葡萄球菌- + + + - -施氏葡萄球菌+ - + + + -路邓葡萄球菌+ - + - + +注：“+”为90%以上菌株为阳性，“--”为90%以上菌株为阳性。
5.5 凝固酶阳性葡萄球菌旳鉴别见下表+腐生葡萄球菌——+ V + +—。
病原性球菌及检验
病原性球菌及检验球菌种类很多，根据革兰氏染色的不同，分为G-、 G+两类球菌。
G+有：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌和微球菌。
G-有：脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、卡他布兰汉氏菌等。
对人体致病的球菌称病原性球菌，因能引起机体化脓性炎症，故又称为化脓性球菌。
常见的有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌。
一、葡萄球菌属(一)形态与染色葡萄球菌呈不规则堆集排列，形似葡萄串状，也可见单个、成对或短链排列。
为G+性球菌，直径0.5-1.5um，（致病性葡萄球菌菌体较非致病性葡萄球菌菌体小）无芽胞，无鞭毛、无荚膜；无动力。
(二)分类 1965年按血浆凝固酶分为：血浆凝固酶阴性葡萄球菌，血浆凝固酶阳性葡萄球菌。
1.血浆凝固酶阴性葡萄球菌包括：表皮、腐生葡萄球菌。
2.血浆凝固酶阳性葡萄球菌包括：金黄色、中间型、家畜葡萄球菌。
(三)抗原本菌水解后，用沉淀法可获两种抗原即蛋白抗原和多糖抗原。
1.蛋白抗原：是一种表面抗原，为完全抗原；有种特异性，无型特异性。
存在葡萄球菌细胞壁的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称葡萄球菌A蛋白。
2.多糖抗原：是半抗原，存在于细胞壁上，是金黄色葡萄球菌的重要抗原。
有型特异性，分A、B、C三型。
(四)标本接种1.脓汁、尿道分泌物、脑脊液沉淀物，通常直接接种在血琼脂上，经37℃24-48h培养，可见直径2-3mm，产生不同色素的菌落。
2.粪便、呕吐物应接种卵黄高盐、高盐甘露醇琼脂平板上，经37℃24-48h培养可形成细小菌落，48h后形成典型菌落。
3.疑为败血症者，抽取静脉血5ml，注入50ml葡萄糖肉汤培养基中。
(五)培养特性需氧或兼性厌氧，对营养要求不高。
在20%CO2环境中，有利于毒力产生。
最适温度37℃，最适PH7.4。
DNA中G+C含量：30-39%。
1.在普通琼脂平板上，经37℃、24-48h培养，可形成圆形，凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、脂溶性色素的菌落，直径一般为1-2mm，但大者也有4-5 mm的菌落。
实验三 食品中金黄色葡萄球菌的检验
计
MPN
三法特点及适用性：
第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定 性检验
第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的 食品中金黄色葡萄球菌的计数 第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而
杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌2、分组：每3人一组 3、评分标准：见附表1
大肠杆菌在普通营养琼脂上的菌落特征： 中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘 整齐
金黄色葡萄球菌在普通营养琼脂平板上的菌落
3、具有高耐盐性，在7.5%氯化钠肉汤中呈现浑浊生 长；
4、在BP平板上菌落特征：圆形、光滑凸起，湿润， 直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色， 周围有一浑浊带，外层有一透明圈；
金黄色葡萄球菌性质及培养特征
1、革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽 孢、无荚膜。
金黄色葡萄球菌的 扫描电镜照片
2、在普通营养琼脂平板上的菌落特征：
经18～24小时培养后形成圆形隆起、边 缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落，直径 为1～2mm，不同菌株可产生不同色素，出现 金黄色、白色、柠檬色。
2.2转种血平板
在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑 色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种 血平板， 于36℃±1℃培养24h后进行染 色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培 养方法。
2.3 菌落计数
将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑 色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数， 除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克 样品中金黄色葡萄球菌数。
2、直接计数方法
2.1 梯度稀释转种BP平板
吸取上述1：10混悬液，进行10倍第次稀释， 根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL， 分别加入三块BP平板，每个平板接种量分别为 0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌涂布器涂布 整个平板，如水分多不易吸收，可将平板放在 36℃±1℃1h，等水分蒸发后反转平皿置 36℃±1℃培养。
葡萄球菌的鉴定
血浆凝 固酶
甘露醇 发酵
金葡
表葡
腐生
（4）新生霉素敏感试验
血平板 菌悬液涂布 5ug/L新生霉素纸片 35℃孵育16~18h S:抑菌圈直径>16mm，R:≤16mm
结果 ATCC25923 表葡 S R
腐生
阳性结果 （S）
实验七 葡萄球菌鉴定
检验系微生物教研室
（一）葡萄球菌检验程序
脓液、咽拭子、穿刺液 尿液、痰液脑脊液血液粪便、呕吐 物
直接涂片染色
初报
分离培养 （血平板）
分离培养
增菌培养 （高盐甘露醇 平板）
涂片染色 触媒 血浆凝固酶 甘露醇发酵 耐热核酸酶 其他鉴定试验
取可疑菌落
鉴定试验
药敏试验
报告
（二）目的要求
培养基：血琼脂平板，MH琼脂，甘露醇发酵管 试剂：生理盐水，3%H2O2,EDTA抗凝兔血浆，革兰染液，
新生霉素纸片、头孢西丁、红霉素、克林霉素纸片 其他：酒精灯，接种环，接种针，玻片，显微镜，孵箱等
（四）步骤方法
1.细菌菌落特征观察：
大小 形态 光泽 表面 边缘 透明度 颜色 溶血 金葡 表葡 腐生
玻片法
【操作】取兔血浆和生理盐水各1滴分别滴于载玻 片上，用接种环挑取细菌，混合后观察。
【操作】
试管法
（3）甘露醇发酵试验：
【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类， 能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。
【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经35℃ 孵育18-24h观察结果。
【结果】金葡为阳性，表皮、腐生为阴性
H2O2
H2O + O2
葡萄球菌属检验方法及临床意义
葡萄球菌属检验方法及临床意义摘要】目的：探讨葡萄球菌属检验方法及临床意义。
方法：选取2014年2月至2016年1月期间，我所检查的葡萄球菌属感染患者31例，对其检验方法及临床意义进行回顾性的分析。
结果：经过实验室检验后，所有患者的样本中均存在葡萄球菌属，葡萄球菌属的实验室检验对病因的确定具有较高的指导意义。
结论：同人类疾病相关的葡萄球菌属主要有表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌及头状葡萄球菌，其会导致化脓性感染及病毒性休克等。
【关键词】葡萄球菌属；检验方法；临床意义【中图分类号】R378.1 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）08-0088-02葡萄球菌属细菌为一类革兰氏阳性球菌，因其常堆集排列呈葡萄串状而取名葡萄球菌属[1]。
葡萄球菌自然界与人体中广泛的存在，其大多数是非致病菌，少数于人与动物皮肤黏膜内存在的菌株会致使多种化脓性的感染，例如菌血症、痈、疖、脓肿等，其还可导致烫伤样的皮肤综合征与毒性的休克综合征等[2]。
葡萄球菌为较为常见的化脓性球菌，同时也是医源性感染中较为常见的细菌。
1.资料与方法1.1 一般资料选取2014年2月至2016年1月期间，我所检查的葡萄球菌属感染患者31例，其中男性患者16例，女性患者15例，患者年龄15至75岁，平均（43.9±15.1）岁。
31例患者中皮肤软组织感染11例，内脏器官感染10例，全身感染8例，尿路感染2例。
1.2 标本采集根据患者发生感染的疾病的不同，可采集其伤口分泌物、脓汁、渗出液、血液、痰液、粪便及脑脊液等[3]。
因葡萄球菌广泛的分布在人体皮肤及黏膜上，因此在采集时需注意避免患者病灶周围的正常菌群的污染。
2.检验2.1 标本的直接检查取患者的痰、渗出物、脓汁及脑脊液在进行离心后取其沉渣进行涂片，经过革兰染色后进行镜检，若在检查后发现革兰阳性菌，即可初步报告为疑为葡萄球菌[4]。
因在正常情况下，关节穿刺液、脑脊液等为无菌的，当检查时发现细菌则具有重要的价值，其他的体液标本中在检查时发现炎性细胞同样具有参考价值。
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葡萄球菌属鉴定
一、目的
对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定
治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；
（4）进行学术交流。
二、原理
根据葡萄球菌的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等
将葡萄球菌由属鉴定到具体种类。
三、标本
不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、
血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。
四、试剂及器材
革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、血浆、玻片、接
种针（环）、酒精灯等。
五、鉴定程序
标本
涂片、染色
痰、脓汁、血、脑脊液粪便、呕吐物
平皿
可凝菌落
纯培养
涂片、染色、触酶实验
葡萄状（G+）、触酶（+）
血浆凝固酶、葡萄糖甘露醇分解、高盐耐受实验
甘露醇分解（需O2、甘露醇分解（—）
厌O2均+）
血浆凝固酶（+）、新生霉素（+）血浆凝固酶（—）
新生霉素
S R
表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌
六、质量控制
每周进行一次葡萄球菌标准菌株的革兰氏染色、触酶、血浆凝固酶及新生霉素实验。
七、实验室解释及临床意义
1、葡萄球菌广泛存在于自然界，医院内葡萄球菌的存在成为院
内交叉感染的重要因素。
2、葡萄球菌是化脓性感染的重要病原菌。
3、葡萄球菌引起尿路感染的比例很大。
八、安全防护措施
在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼
罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实
验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。
九、标本处理
废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。
十、参考文献
诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。