第六节 酶工程制药part2
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酶工程制药技术 (2)PPT讲稿
3.有机相的酶反应——在含有有机溶剂的介质 中进行的催化反应。
增加疏水性物质的溶解度 热力学平衡向合成方向移动 可抑制有水参与的副反应 利于酶的回收再利用 容易从沸点低的溶剂中分离产物 酶的热稳定性高，pH适应性扩大 无微生物污染 能测定水介质中不易测定的常数 固定化酶法简单
（一）酶工程的研究进展
• 重氮化
酸酐活化法 异硫氰酸酯法 溴化氰活化法 硅烷基化法
迭氮化 酰氯法 缩合剂法 烷基化法纪
L-氨基酸 磷酸二酯酶
（一）酶工程的研究进展
亲和层析
第二节 工程制药酶 一、工程制药酶的来源
一、工程制药酶的来源
微生物种类繁多
1
繁殖快、生产周 期短、培养简便
微生物生产酶 制剂特点
2
3
适应性强，能通 过遗传变异手段 培育高产菌株
一、影响工程制药酶活性的因素
底物浓度
酶浓度
底物过量
温度
pH
C、常用的吸附剂
（2）离子结合法
A、离子结合法的优点----操作简单、处理条件温和，酶的活 性中心不容易被破坏。
B、离子结合法的缺点----载体和酶的结合力较弱、常常发生 酶脱落的现象
C、常用的离子结合剂 树脂----阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换
剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50150mg酶蛋白。 DEAE-纤维素 Amberlite-CG-50 Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45 Dowex-50
（3）共价键结合法
酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表 面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的 方法。
A、共价键结合法的优点----酶与载体结合牢固，酶不会 发生脱落。
增加疏水性物质的溶解度 热力学平衡向合成方向移动 可抑制有水参与的副反应 利于酶的回收再利用 容易从沸点低的溶剂中分离产物 酶的热稳定性高，pH适应性扩大 无微生物污染 能测定水介质中不易测定的常数 固定化酶法简单
（一）酶工程的研究进展
• 重氮化
酸酐活化法 异硫氰酸酯法 溴化氰活化法 硅烷基化法
迭氮化 酰氯法 缩合剂法 烷基化法纪
L-氨基酸 磷酸二酯酶
（一）酶工程的研究进展
亲和层析
第二节 工程制药酶 一、工程制药酶的来源
一、工程制药酶的来源
微生物种类繁多
1
繁殖快、生产周 期短、培养简便
微生物生产酶 制剂特点
2
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适应性强，能通 过遗传变异手段 培育高产菌株
一、影响工程制药酶活性的因素
底物浓度
酶浓度
底物过量
温度
pH
C、常用的吸附剂
（2）离子结合法
A、离子结合法的优点----操作简单、处理条件温和，酶的活 性中心不容易被破坏。
B、离子结合法的缺点----载体和酶的结合力较弱、常常发生 酶脱落的现象
C、常用的离子结合剂 树脂----阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换
剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50150mg酶蛋白。 DEAE-纤维素 Amberlite-CG-50 Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45 Dowex-50
（3）共价键结合法
酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表 面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的 方法。
A、共价键结合法的优点----酶与载体结合牢固，酶不会 发生脱落。
第六章酶工程制药
2021/3/12
第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
按照模拟酶的属性
主-客体酶模型 胶束酶模型 肽酶 抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
主-客体酶模型
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
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第六章酶工程制药
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五、固定化方法与载体的选择依据
2、载体的选择
为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量 应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻 胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都 是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物 的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化 酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或粘度大，宜 采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以 便实现转化反应和回收固定化酶。
五、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择
⑴ 固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域 的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和 残留。尽可选择无毒性试剂。
⑵ 固定化酶在操作上中的稳定性：在选择固定化方法 时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反 复使用，在经济上有极强的竞争力。
⑶ 固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包 括水、电、气、设备和劳务投资等。
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
酶工程制药课件
2.酶化学修饰的目的：
a.提高生物活性
胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘
组
46
丝
S S
活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S
18 3
S S
S S
b.增强在不良环境中的稳定性 c.针对异体反应，降低生物识别能力
二、化学修饰的方法
化学修饰方法的几个问题 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条
哈尔滨医科大学 药学院生物制药教研室
第六章 酶工程制药
第五节三、进化酶
四、抗体酶
人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为 制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所 以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要 是为了解决酶的以上缺点。
2.酶分子内部修饰
3.结合定点突变的化学修饰
三、修饰酶的特性
1.热稳定性提高 2.抗各类失活因子能力提高 3.抗原性消除 4.体内半衰期延长 5.最适pH改变 6.酶学性质变化 7.对组织分布能力改变
四、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离 得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过 离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解 生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离 酶生产成本的60％左右。
二硫键的化学修饰
氨基的化学修饰
第六章酶工程制药
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B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
生物技术制药——第六章 酶工程制药
2、酶的提取
3、酶的分离方法
4、酶的组合分离纯化策略
5、酶的浓缩、干燥与结晶
一、酶的分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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二、酶的提取
JY92-II D超声波
化学合成：固相合成多肽技术
早期酶的生产多以动植物为主要原料
植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶主要有：
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的
凝乳酶等。
不适合大规模生产：动植物来源有限、生
产周期长，以及地理、气候和季节影响。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源
酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测
定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
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(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于 组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内 的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此， 可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断
和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固 定化酶。 郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用 的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工 程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子 等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。
酶工程制药常用技术及应用
酶工程制药常用技术及应用酶工程制药常用技术及应用酶是由生物体活细胞产生的具有催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。
具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。
酶作为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。
近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。
酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。
它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。
酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。
一、酶工程制药的基本技术现代酶工程制药的基本技术主要包括酶和细胞的固定化、酶的化学修饰、酶法的手性药物合成技术等。
1.酶和细胞的固定化技术酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。
酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。
便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。
固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
酶和细胞的固定化方法有：吸附、共价结合、包埋、选择性热变性、光照、辐射和定点固定化技术等，在制药工业中，包埋法应用较多，其次为吸附法。
固定化细胞包括微生物细胞（包括基因工程菌）、动物和植物细胞。
植物细胞固定化一般采用包埋法，在中药有效成分的应用上具有广阔的前景，至今研究成功的固定化植物细胞有固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等10多种。
动物细胞有固定化主要用吸附法和包埋法，目前动物细胞微囊化固定法使其研究的热点，动物细胞有固定化技术现已成功应用于药物药物筛选模型、单克隆抗体、白细胞介素、干扰素等药物的生产过程。
酶工程制药BETA
高效合成。同时，通过对发酵过程的优化和控制，可以提高产物的纯度
和收率。
03
酶工程制药工艺流程
原料选择与预处理
原料选择
选择适合酶催化反应的底物，如生物 大分子、有机小分子等，确保原料的 纯度和质量。
预处理
对原料进行必要的预处理，如破碎、 溶解、除杂等固定化技术
固定化方法
酶的固定化可以通过物理吸附、化学交联、包埋法等方法实现， 将酶固定在载体上，提高酶的稳定性和重复使用性。
固定化酶的性质
固定化酶具有与游离酶相似的催化活性，同时具有良好的稳定性、 可重复使用性和易于与产物分离等优点。
固定化酶的应用
固定化酶在药物合成中可以用于连续反应、多步反应和固定床反应 器等，提高药物合成的效率和经济性。
血管紧张素转化酶抑制剂 生产
利用酶工程技术改进血管紧张素转化酶抑制 剂生产工艺，提高产量和纯度。采用固定化
酶技术降低生产成本和简化操作。
06
酶工程制药挑战与解决方案
技术挑战及应对策略
酶的表达与纯化
提高酶的表达水平，优化纯化方法，以获得高纯度、高活性的酶 制剂。
酶的固定化与修饰
研究新的固定化方法和修饰技术，提高酶的稳定性、选择性和催化 效率。
性、密封性等因素。
操作方法和注意事项
发酵罐操作前应检查设备是否完好，对培养基和接种物进行预处理，控 制好温度、pH、溶氧等参数，避免污染和发酵异常。
离心机操作前应检查设备是否平衡，选择合适的转子和转速，控制好进 料速度和分离时间，避免设备过载和酶活性损失。
层析柱操作前应选择合适的层析介质和缓冲液，对样品进行预处理，控 制好流速和洗脱条件，避免层析柱堵塞和酶活性损失。同时应注意设备 的清洗和保养，以延长使用寿命。
六酶工程制药PPT学习教案
研究。
第1页/共68页
二、酶的来源
提取分离法：动物、植物组织、器官、细胞 生物合成法：动物、植物、微生物细胞 化学合成法：实验室阶段，尚不成熟
第2页/共68页
微生物发酵生产酶的优势
1、微生物种类多，酶的品种齐全； 2、微生物繁殖快，生长周期短，产量高； 3、微生物培养方法简单，原料来源丰富，价格
第28页/共68页
2、偶联率及相对活力的测定
偶联率=（加入酶活力-上清酶活力）/加入蛋白活力 x100%
活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力x100%
相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中 未偶联酶活力）x100% 偶联率=1时，表示反应控制良好；偶联率<1时， 扩散限制对酶活力有影响；偶联率>1时,有细胞分裂 或从载体排除抑制剂等原因。
方法人为制造的具有酶性质的催化剂。
第35页/共68页
二.模拟酶的理论基 础
1.模拟酶的酶学基础
酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定反 应的过度态（TS），降低反应活化能，从而加快反 应速度。
2.主-客体化学和超分子化学
主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的互相 作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子 排列的互补。
第29页/共68页
第三节 固定化酶和固定 化细胞的反应器
一、反应器的类型和特点
⒈间歇式搅拌罐反应器（BSTR） 用于游离酶反应后随即放料。
⒉连续流动搅拌罐反应器（CSTR） 连续进料、连续出料
第30页/共68页
⒊填充床反应器（PBR）
固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的 流动形态为平推流形。
底物以恒定流速通过反应床。
第13页/共68页
⑴载体结合法 ①物理吸附法 ②离子结合法 ③共价结合法
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二、酶的来源
提取分离法：动物、植物组织、器官、细胞 生物合成法：动物、植物、微生物细胞 化学合成法：实验室阶段，尚不成熟
第2页/共68页
微生物发酵生产酶的优势
1、微生物种类多，酶的品种齐全； 2、微生物繁殖快，生长周期短，产量高； 3、微生物培养方法简单，原料来源丰富，价格
第28页/共68页
2、偶联率及相对活力的测定
偶联率=（加入酶活力-上清酶活力）/加入蛋白活力 x100%
活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力x100%
相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中 未偶联酶活力）x100% 偶联率=1时，表示反应控制良好；偶联率<1时， 扩散限制对酶活力有影响；偶联率>1时,有细胞分裂 或从载体排除抑制剂等原因。
方法人为制造的具有酶性质的催化剂。
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二.模拟酶的理论基 础
1.模拟酶的酶学基础
酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定反 应的过度态（TS），降低反应活化能，从而加快反 应速度。
2.主-客体化学和超分子化学
主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的互相 作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子 排列的互补。
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第三节 固定化酶和固定 化细胞的反应器
一、反应器的类型和特点
⒈间歇式搅拌罐反应器（BSTR） 用于游离酶反应后随即放料。
⒉连续流动搅拌罐反应器（CSTR） 连续进料、连续出料
第30页/共68页
⒊填充床反应器（PBR）
固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的 流动形态为平推流形。
底物以恒定流速通过反应床。
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⑴载体结合法 ①物理吸附法 ②离子结合法 ③共价结合法
第6章 酶工程制药(二)
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5. 印迹酶
分子印迹：制备对某一特定分子具有选择性的聚 合物的过程。该特定分子称为印迹分子或模板。
（1）分子印迹的原理 分子印迹的过程：
1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补 作用，形成印迹分子功能单位复合物。
2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚 合反应，形成交联的聚合物。
➢ 由几个D-(+)-吡喃葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连 接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子
类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多 羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。
➢ 环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环 糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分 相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。
3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有 选择性的聚合物。
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（2）印迹分子与单体相互作用的类型
印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。
非共价分子印迹：首先是印迹分子与功能单位相 混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位 与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物， 最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在 形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别 部位。
5、前景
酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可 以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应 选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程 法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰 法等，使酶的性质进一步改善。
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第六节 酶工程研究的进展
一、有机相的酶反应 20世纪80年代中期，A. M. Klibanov等人打
酶工程制药
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3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
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酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
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许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
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3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
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青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
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6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
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2018/11/22
第五节
酶工程的研究实例
固定化青霉素酰化酶制备D-苯丙氨酸
2018/11/22
35
第五节
酶工程的研究实例
O OH NH2 DL-苯丙氨酸
COCl
3N盐酸 回流2h 冰醋酸 乙酸酐60℃ O OH NH2 L-苯丙氨酸 O
DL-苯丙氨酸 NaOH溶液 O OH HN O 固定化青霉素酰化酶 水溶液 N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸
可组装成列管反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、
脲酶等酶管。
2018/11/22 4
2、固定化酶的性质
⑴ 酶活力的变化
酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活 性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构 发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋
法中还有底物与产物扩散阻力增大。
2018/11/22
蛋白质（链激酶、尿激酶等）、PEG－天门冬酰胺酶
（ASNase）
2018/11/22 25
第四节
酶的表面化学修饰
酶的化学修饰
小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包
括氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
主要反应：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、 芳香环取代反应
19
第三节
分子印迹酶
酶的人工模拟
通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中 心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可 以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并
与底物定向排列。
性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度
常数。
2018/11/22
20
第四节
天然酶的缺陷
酶的化学修饰
易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；
三、模拟酶的分类
主-客体酶模型 胶束酶模型
肽酶
抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
2018/11/22
15
第三节
酶的人工模拟
主-客体酶模型
2018/11/22
16
第三节
酶的人工模拟
胶束酶模型
模拟的胰凝乳蛋白酶侧链上接上羟基、咪唑基、羧基。
2018/11/22 17
第三节
酶的人工模拟
分子印迹酶模型
2018/11/22
3
⑶ 膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联
在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，
渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。 目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶、脲酶等 酶膜。
⑷管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙，
聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联的酶管。 酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也
2018/11/22
10
第三节
稳定过渡态理论
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定 反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快 反应速度。模拟酶要和酶异养能够在结合底物的过 程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低 反应的活化能。
2018/11/22
11
第三节
2018/11/22
8
第三节
酶的人工模拟
一、模拟酶的概念
人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方 法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模
拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构
上比天然酶相对简单。
2018/11/22
9
第三节
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
稳定过渡态理论
主客体化学和超分子化学
2018/11/22 29
第四节
芳香环取代反应
碘代： I2＋ 硝化：
(NO2)4C +
四硝基甲烷
酶的化学修饰
+ HI
+ (NO2)3CH
2018/11/22
30
第四节
酶的化学修饰
交联修饰（交联法）
用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内 不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象 更加稳定。
2018/11/22
2018/11/22 6
C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大，热稳 定性高，可以提高反应温度和反应速度，提高效率。
D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋
白酶耐受力有所提高，可能的原因是由于空间位阻效 应是蛋白酶不能进入固定化酶内部。
2018/11/22
7
⑶ 酶学特性的变化：
A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲 线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质 有关。 C、最适温度：一般升高，原因是固定化后空间结构更为 稳定。 D、米氏常数（Km）：Km值均发生变化，有的增加很小 ，有的增加很大，但不会变小。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不定。
从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件
下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂其特异反
应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的
化学改变。
2018/11/22
22
第四节
酶的化学修饰
2. 酶的化学修饰的目的
酶的化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一
些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造 出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发 展。① 提高生物活性；② 增强在不良环境中的稳定性 ；③针对异体反应，降低生物识别能力。
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形 成稳定复合物的化学领域称为主-客体化学。本质上 ，主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作 用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排
列的互补。
2018/11/22
12
第三节
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结 合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范 德华力等，当接受体与络合离子或分子结合成稳定 的、具有稳定结构和性质的实体时，即形成了超分
子。它兼具分子识别、催化和选择输出的功能。
2018/11/22
13
第三节
根据Kirby分类法
酶的人工模拟
2018/11/22 38
第五节
难点1：
酶工程的研究实例
N-苯乙酰-D-苯丙氨酸的水解和结晶：
粗制的酰化物的产品纯度不高
分析：产品中混有L-苯丙氨酸和盐
解决方法:利用L-苯丙氨酸不溶于有机溶剂的物理特性, 用乙醇溶解粗制酰化物，将不溶的L-苯丙氨酸和盐滤除, 再旋蒸除去乙醇，得到精制的酰化物，由于将少量的L苯丙氨酸和盐除去,从而提高了N-苯乙酰-D-苯丙氨酸产 品纯度。
31
第四节
酶的化学修饰
固定化修饰（共价偶联法）
通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连
接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生
改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发
生改变。
2018/11/22
32
第四节
酶分子内部修饰
酶的化学修饰
（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） （二）氨基酸置换修饰（催化和非催化活性 基团的修饰）
Ph
Cl O +
COOH NH2
NaOH 溶液 pH 9~10,0~5℃
NH O COOH
2018/11/22
37
第五节
N-苯乙酰化反应：
酶工程的研究实例
实验证明此法合成N-苯乙酰化合物的纯度很高， 几乎无副产物生成，而且苯乙酰化苯丙氨酸的水溶 性很差，很容易从水溶液中提纯，收率高。 在用固定化青霉素酰化酶手性拆分DL-苯丙氨酸 中，将DL-苯丙氨酸先苯乙酰化生成N-苯乙酰-DL-苯 丙氨酸。反应在pH：12-13的NaOH碱性条件下收率达 74.3%。
容易受产物和抑制剂的抑制；
工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的 最适酸度和温度范围内； 底物不溶于水，或酶的米式常数过高； 酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶 制剂的应用。
21
2018/11/22
第四节
1. 酶的化学修饰
酶的化学修饰
从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或
破坏的转变都可以看做是酶的化学修饰。
5
⑵ 酶稳定性的变化
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。
固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
修饰剂：采用的各种小分子化合物，如2，4－二硝 基氟苯、碘乙酸；乙酸酐、邻苯二酸酐；H2O2、2－
巯基乙醇；四硝基甲烷、卤素。
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第四节
烷基化反应
酶的化学修饰
2018/11/22
27
第四节
酰基化反应
酶的化学修饰
2018/11/22
28
第四节
氧化还原反应
酶的化学修饰
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
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第五节
酶工程的研究实例
固定化青霉素酰化酶制备D-苯丙氨酸
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酶工程的研究实例
O OH NH2 DL-苯丙氨酸
COCl
3N盐酸 回流2h 冰醋酸 乙酸酐60℃ O OH NH2 L-苯丙氨酸 O
DL-苯丙氨酸 NaOH溶液 O OH HN O 固定化青霉素酰化酶 水溶液 N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸
可组装成列管反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、
脲酶等酶管。
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2、固定化酶的性质
⑴ 酶活力的变化
酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活 性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构 发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋
法中还有底物与产物扩散阻力增大。
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蛋白质（链激酶、尿激酶等）、PEG－天门冬酰胺酶
（ASNase）
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第四节
酶的表面化学修饰
酶的化学修饰
小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包
括氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
主要反应：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、 芳香环取代反应
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第三节
分子印迹酶
酶的人工模拟
通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中 心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可 以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并
与底物定向排列。
性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度
常数。
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第四节
天然酶的缺陷
酶的化学修饰
易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；
三、模拟酶的分类
主-客体酶模型 胶束酶模型
肽酶
抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
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第三节
酶的人工模拟
主-客体酶模型
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酶的人工模拟
胶束酶模型
模拟的胰凝乳蛋白酶侧链上接上羟基、咪唑基、羧基。
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第三节
酶的人工模拟
分子印迹酶模型
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3
⑶ 膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联
在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，
渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。 目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶、脲酶等 酶膜。
⑷管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙，
聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联的酶管。 酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也
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第三节
稳定过渡态理论
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定 反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快 反应速度。模拟酶要和酶异养能够在结合底物的过 程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低 反应的活化能。
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第三节
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第三节
酶的人工模拟
一、模拟酶的概念
人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方 法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模
拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构
上比天然酶相对简单。
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第三节
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
稳定过渡态理论
主客体化学和超分子化学
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第四节
芳香环取代反应
碘代： I2＋ 硝化：
(NO2)4C +
四硝基甲烷
酶的化学修饰
+ HI
+ (NO2)3CH
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第四节
酶的化学修饰
交联修饰（交联法）
用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内 不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象 更加稳定。
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C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大，热稳 定性高，可以提高反应温度和反应速度，提高效率。
D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋
白酶耐受力有所提高，可能的原因是由于空间位阻效 应是蛋白酶不能进入固定化酶内部。
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⑶ 酶学特性的变化：
A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲 线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质 有关。 C、最适温度：一般升高，原因是固定化后空间结构更为 稳定。 D、米氏常数（Km）：Km值均发生变化，有的增加很小 ，有的增加很大，但不会变小。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不定。
从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件
下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂其特异反
应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的
化学改变。
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第四节
酶的化学修饰
2. 酶的化学修饰的目的
酶的化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一
些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造 出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发 展。① 提高生物活性；② 增强在不良环境中的稳定性 ；③针对异体反应，降低生物识别能力。
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形 成稳定复合物的化学领域称为主-客体化学。本质上 ，主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作 用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排
列的互补。
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第三节
酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结 合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范 德华力等，当接受体与络合离子或分子结合成稳定 的、具有稳定结构和性质的实体时，即形成了超分
子。它兼具分子识别、催化和选择输出的功能。
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第三节
根据Kirby分类法
酶的人工模拟
2018/11/22 38
第五节
难点1：
酶工程的研究实例
N-苯乙酰-D-苯丙氨酸的水解和结晶：
粗制的酰化物的产品纯度不高
分析：产品中混有L-苯丙氨酸和盐
解决方法:利用L-苯丙氨酸不溶于有机溶剂的物理特性, 用乙醇溶解粗制酰化物，将不溶的L-苯丙氨酸和盐滤除, 再旋蒸除去乙醇，得到精制的酰化物，由于将少量的L苯丙氨酸和盐除去,从而提高了N-苯乙酰-D-苯丙氨酸产 品纯度。
31
第四节
酶的化学修饰
固定化修饰（共价偶联法）
通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连
接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生
改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发
生改变。
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第四节
酶分子内部修饰
酶的化学修饰
（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） （二）氨基酸置换修饰（催化和非催化活性 基团的修饰）
Ph
Cl O +
COOH NH2
NaOH 溶液 pH 9~10,0~5℃
NH O COOH
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第五节
N-苯乙酰化反应：
酶工程的研究实例
实验证明此法合成N-苯乙酰化合物的纯度很高， 几乎无副产物生成，而且苯乙酰化苯丙氨酸的水溶 性很差，很容易从水溶液中提纯，收率高。 在用固定化青霉素酰化酶手性拆分DL-苯丙氨酸 中，将DL-苯丙氨酸先苯乙酰化生成N-苯乙酰-DL-苯 丙氨酸。反应在pH：12-13的NaOH碱性条件下收率达 74.3%。
容易受产物和抑制剂的抑制；
工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的 最适酸度和温度范围内； 底物不溶于水，或酶的米式常数过高； 酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶 制剂的应用。
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第四节
1. 酶的化学修饰
酶的化学修饰
从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或
破坏的转变都可以看做是酶的化学修饰。
5
⑵ 酶稳定性的变化
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。
固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
修饰剂：采用的各种小分子化合物，如2，4－二硝 基氟苯、碘乙酸；乙酸酐、邻苯二酸酐；H2O2、2－
巯基乙醇；四硝基甲烷、卤素。
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第四节
烷基化反应
酶的化学修饰
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酰基化反应
酶的化学修饰
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氧化还原反应
酶的化学修饰
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
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