生物表面活性剂产生菌株BYS6的分离筛选与鉴定
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
微生物菌株的筛选和开发
微生物菌株的筛选和开发微生物菌株是一类生活在我们周围的小型生物体，它们在生物学和工程学领域中都有着重要的应用。
微生物菌株有着多样的来源，例如土壤、水源、动物肠道等等。
对菌株的筛选和开发对于研究人员来说是一项非常重要的任务。
一、微生物菌株的筛选微生物菌株的筛选是一个相当繁琐且复杂的过程。
常见的菌株筛选方法包括采用传统的分离鉴定法和基于高通量技术的筛选法，随着技术的发展，不同的菌株筛选方法相继呈现出来。
传统的分离鉴定法主要是将分离出的微生物菌株按照形态、生理生化特性等进行鉴定，但其筛选效率低，时间成本高。
而高通量技术则是运用现代技术手段来对微生物菌株进行筛选，如利用PCR 扩增、全基因组测序等。
此种方法能够在较短时间内进行多维度筛选，同时能够分析到分子水平的信息，充分挖掘微生物菌株的潜力。
二、微生物菌株的开发对于筛选出来的微生物菌株而言，如何进行开发变得至关重要。
常见的微生物菌株开发方式主要有两类，分别是生产有用物质和环境治理。
生产有用物质方面，微生物菌株具有一定的有用物质生产能力，如抗生素、代谢产物等。
其开发方式可以通过优化培养条件、引入外源基因等手段来实现产量的提高。
环境治理方面，微生物菌株可以利用其各种生理特性来植入环境中，降解污染物、调节环境等。
典型的如利用微生物菌株来处理废水、有机废料等。
三、微生物菌株的应用微生物菌株的应用范围非常广泛，如食品、医药、工业等。
食品方面，微生物菌株可以用来制作乳制品、调味品等，例如酸奶、豆酱等。
医药方面，微生物菌株常被用来提取疫苗、抗菌素、代谢物等，例如云芝、链霉菌等。
工业方面，微生物菌株可以用来生产发酵工业品，如酿酒、乳酸等。
此外也可以利用微生物菌株来提取能源，例如利用微生物发酵生产生物柴油、生产生物气等。
总之，微生物菌株的筛选和开发在现代科学中扮演着越来越重要的角色。
研究人员们需要通过创新的手段来发掘和开发微生物菌株的潜力，从而更好地服务于人类的生产生活。
芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程
芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法
一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法王大威;张健;姜伟;张凤久【摘要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】5页(P142-146)【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳【作者】王大威;张健;姜伟;张凤久【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027【正文语种】中文脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广泛的应用[1] 。
大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居多。
目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。
实验二重要功能微生物的筛选及生物学特性
• 重要功能微生物
– – – – 农业微生物（磷细菌） 环境微生物（重金属抗性细菌） 工业微生物（生物表面活性剂产生菌） 医药微生物（放线菌）
• 筛选
– 系列稀释，平板培养，选择性培养基
• 生物学特性
– 菌落特征，菌体特征，革兰氏反应，功能大小 等
1、磷细菌的筛选
2、重金属Cu抗性细菌的筛选
• 样品：土壤 • 培养基：1/10 LB(1000ml)
– 酵母膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 1g pH 7.0 琼脂 2%， 配制600ml，分装至3个250ml的三角瓶，灭菌待用
• 无菌水
– 准备100ml无菌水置于250ml三角瓶中，内加5颗玻璃珠， 灭菌待用。 – 准备3根试管，每根加入9ml无菌水，加塞，灭菌待用。
挑取菌落，进行革兰氏染色，并进行镜检，对所 观察到的细菌进行形态描述。
实验结果
1.观察菌落并将实验结果记录下表
菌落形态
不同溶磷 菌落 1 2 3 …… 形状 大小 颜色 透明 粘稠 边缘 形状
溶磷ห้องสมุดไป่ตู้力
菌落 溶磷圈 圈径/ 直径 直径 菌径 (mm) (mm)
2.选取（不同形态）菌落1-2个制作装片，显微镜观察结果记录下表
② 培养基：无机磷培养基
③
实验步骤
① 配制无机磷培养基100ml， ② 取250ml三角瓶，向其中加入100ml去离子水和几颗小玻璃珠， 再取三只试管各加9mL去离子水，将准备好的上述材料在 115℃下灭菌25分钟。灭完菌好待培养基冷却到60℃左右倒 平板6块。 ③ 称取土壤样品1g，加入到加有玻璃珠的100ml无菌水中，震 荡30分钟，配成10-2菌悬液。 ④ 吸取1mL菌液加入到装有9mL无菌水的试管中，震荡均匀， 配成10-3菌悬液。如法依次制成10-4 、10-5 的菌悬液。 ⑤ 吸取各稀释度的菌悬液100μL加入到冷却的平板中，稀释涂 布，倒置放入30℃恒温培养箱中培养。 ⑥ 待菌体长出，观察细菌菌落形态和溶磷菌溶磷圈。并测量溶 磷菌菌落直径和溶磷圈直径，计算比值，定性比较各溶磷菌 落溶磷能力。 ⑦ 制片，革兰氏染色，镜检，观察菌体形态等特性。
乳酸菌生物表面活性剂的制备、表征及性质研究
乳酸菌生物表面活性剂的制备、表征及性质探究表面活性剂是一类能够降低液体表面张力并在液体与固体或气体之间形成界面活性分子膜的物质。
传统的化学合成表面活性剂具有一定的毒性和环境污染问题。
因此，近年来，寻找生物来源的表面活性剂成为了探究的热点之一。
乳酸菌生物表面活性剂由于其自然来源、良好的生物相容性和低毒性被广泛关注。
本文将对乳酸菌生物表面活性剂的制备方法、表征技术以及其性质进行详尽探讨。
1. 乳酸菌生物表面活性剂的制备方法乳酸菌生物表面活性剂的制备方法主要包括发酵法、提取法和基因工程法。
1.1 发酵法发酵法是最常用的制备乳酸菌生物表面活性剂的方法之一。
一般来说，选择具有高表面活性剂产量的乳酸菌菌种，通过培育和发酵过程中，利用其代谢产生的表面活性剂。
1.2 提取法提取法是从乳酸菌培育物中通过物理或化学方法将表面活性剂提取出来。
常用的提取方法包括萃取、超滤和蒸发浓缩等。
这种方法能够得到纯度较高的表面活性剂。
1.3 基因工程法基因工程法是一种新兴的制备乳酸菌生物表面活性剂的方法。
通过将具有表面活性剂合成基因的乳酸菌细胞（通常是乳酸菌菌株）转化或引入至乳酸菌中，使得该细菌在培育过程中能够合成表面活性剂。
2. 乳酸菌生物表面活性剂的表征技术乳酸菌生物表面活性剂的表征技术主要包括动态表面张力测定、气液界面测定和电镜观察等。
2.1 动态表面张力测定动态表面张力测定是通过测量液体表面张力随时间的变化，获得表面活性剂的降低效果。
最常用的测定方法是威利乌斯滴定法和环压法。
2.2 气液界面测定气液界面测定用于探究乳酸菌生物表面活性剂在气液界面的行为。
常用的试验方法有气体吸附法、气体扩散法和质谱法等。
2.3 电镜观察电镜观察是利用透射电镜和扫描电镜等技术，观察乳酸菌生物表面活性剂的形态结构。
通过观察表面活性剂的形态，可以评估其在界面活性上的性质。
3. 乳酸菌生物表面活性剂的性质探究乳酸菌生物表面活性剂具有良好的生物相容性、低毒性和优异的表面活性性质，逐渐成为食品、医药等领域的探究热点。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种的性能是最重要的因素。
（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;（4）能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。
当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
（二）微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。
⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。
微生物代谢产物的分离提取和鉴定
微生物代谢产物的分离提取和鉴定微生物代谢产物是微生物在生长过程中产生的一系列化合物，具有广泛的生物活性和医药应用价值。
其分离提取和鉴定是微生物学研究中的重要内容之一。
1. 微生物代谢产物的分离提取微生物代谢产物的分离提取可以通过以下几种方法进行：1.1 生物筛选法生物筛选法是利用微生物自身代谢特性进行分离提取的方法。
通过对微生物菌种的筛选和培养，可以筛选出产生特定活性物质的微生物。
随着技术的不断发展，生物筛选法已经成为了有机合成方法的重要补充。
1.2 萃取法萃取法是通过溶剂的物理性质差异对微生物代谢产物进行提取的方法。
通常使用有机溶剂（如氯仿、乙酸乙酯、丙酮等）进行萃取，将样品与溶剂混合，使化合物转移到到溶液中，然后再经过干燥等处理得到分离提取物。
1.3 分离柱层析法分离柱层析法是将萃取物通过固相柱进行分离的方法。
柱层析常用于研究样品中单一化合物的分离和纯化。
主要利用化合物在某些材料表面的化学吸附和排斥作用分离化合物，从而得到纯度较高的代谢产物。
2. 微生物代谢产物的鉴定微生物代谢产物的鉴定可以通过以下几种方法进行：2.1 紫外-可见吸收光谱法紫外-可见吸收光谱法是利用化合物分子在特定波长的光照射下所产生的吸收作用实现鉴定的方法。
这种方法非常适用于含有含电子共轭体系的化合物，如吲哚、噻吩类化合物等。
2.2 质谱法质谱法通常被视为微生物代谢产物鉴定的“金标准”。
它可以提供高灵敏度、高分辨率、高质量的分析结果，从而鉴定出代谢产物的分子式、结构特征和精确的分子量等信息。
2.3 核磁共振波谱法核磁共振波谱法是一种非常常用的分析方法，其主要原理是通过核磁共振现象对化合物进行鉴定。
不同类型的原子具有不同的核磁共振反应，从而可以进一步鉴定分子中含有哪些原子，并得到化合物的结构信息。
3. 结语微生物代谢产物的分离提取和鉴定是微生物研究中的重要环节，它为揭示微生物代谢途径、开发新型抗生素等提供了重要的实验支持。
随着科技的不断发展，微生物代谢产物的分离提取和鉴定技术也将不断地完善和提高。
筛选菌种的四个步骤
筛选菌种的四个步骤筛选菌种是指通过一系列实验和评估来确定最适合特定应用的微生物菌株。
下面将介绍筛选菌种的四个步骤：1.初始筛选：2.生物活性筛选：在生物活性筛选阶段，我们通过对菌株的生物活性进行评估来确定其具有潜在用途的能力。
这通常包括筛选抗生素产生菌、产酶菌株等。
首先进行抗菌活性筛选，将菌株培养在富含病原菌的琼脂平板上，观察是否有抗菌圈产生。
然后，进行产酶筛选，比如进行淀粉酶、纤维素酶等酶的产生能力的评估。
此外，还可以通过对菌株的生态学行为、对有毒物质的降解能力等进行评估。
3.遗传特性筛选：在遗传特性筛选阶段，我们关注的是菌株的遗传特征。
这通常包括筛选具有高产能、稳定性和耐受性等特性的菌株。
这一步骤通常涉及菌株的基因分析，如PCR、序列测定等。
通过对菌株的基因组和基因表达数据进行分析，我们可以确定菌株的基因组组成、功能基因和代谢途径等。
此外，还可以使用基因工程技术来改良菌株的特性，例如通过基因突变或基因组互换等。
4.应用评估：应用评估是最后一步，用来评估菌株在特定应用中的实际效果。
这个步骤通常包括菌株的生物质量产量、产物纯度和质量等因素的评估。
此外，还可以考虑菌株的生长特性、代谢路径和产物稳定性等。
通过与已经商业化或研究中的菌株进行比较，可以确定最具潜力的菌株，并进一步开发应用。
总结起来，筛选菌种的四个步骤包括初始筛选、生物活性筛选、遗传特性筛选以及应用评估。
这四个步骤通过从原始样品中筛选出具有潜在应用的微生物菌株，并对其进行评估，以确定最适合特定应用的菌株。
这些步骤的目的是发现具有特殊功能的微生物菌株，并利用它们在农业、医药、环境等领域的广泛应用。
产生物表面活性剂细菌的筛选及发酵条件优化_张卉
第23卷 第1期沈 阳 化 工 学 院 学 报Vol .23 No .12009.03JOURNAL OF SHENY ANG UN I V ERSI TY OF CHE M I CAL TECHNOLOGYMar .2009收稿日期: 2008-01-04作者简介: 张卉(1968-),女,辽宁沈阳人,副教授,博士,主要从事生物活性物质和微生物资源化的研究.文章编号: 1004-4639(2009)01-0021-05产生物表面活性剂细菌的筛选及发酵条件优化张 卉, 尚双华, 温晨光, 柳娉婷, 苗天锦(沈阳化工学院环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142)摘 要: 利用变色圈法、排油圈法从土壤和污泥等样品中分离筛选出1株产生物表面活性剂的细菌菌株WB,并通过单因素实验及L 9(34)正交实验对该菌株的培养基配方及培养条件进行优化.结果表明:在葡萄糖10g/L,麸皮25g/L,酵母粉019g/L,培养基初始pH 值为712,250mL 摇瓶装液量为50mL,发酵时间为72h 的条件下,菌株WB 的表面活性剂的产量可达316g/L.关键词: 生物表面活性剂; 菌株筛选; 条件优化中图分类号: X172 文献标识码: A 生物表面活性剂(bi osurfactants )是微生物在代谢过程中分泌的具有一定表面和界面活性,同时含有亲水基和疏水基的两性化合物[1].生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似,除具有降低表面张力、稳定乳化液等特性外,还具有无毒、可自然生物降解、生态安全及高表面活性和生理活性等优点,愈来愈受到人们的青睐,在食品工业、化工、医药、石油和环境工程等领域都得到不同程度的应用[2-5].本文从被原油长期污染的污泥和土壤中筛选到一株产生生物表面活性剂的细菌,并通过发酵培养的方法使之产生生物表面活性剂,同时对菌株的发酵培养基的成分和发酵培养条件进行了优化.1 材料和方法111 样品来源沈阳北部污水处理厂的活性污泥、被原油长期污染的油田土壤、汽车修配厂的锯末、食堂和饭店下水道的污泥等.112 培养基配方富集培养基:(NH 4)2S O 4210g,KCl0111g,KH 2P O 4314g,K 2HP O 4414g,MgS O 4・7H 2O 015g,FeS O 4・7H 2O 215×10-5g,E DT A 1g,酵母浸粉015g,液体石蜡5m l,用去离子水定容至1L,pH 712～714[6-8].蓝色凝胶培养基: 十六烷三甲基溴化铵5g,次甲基蓝0102g,琼脂20g,去离子水定容至1L,pH 712～714[9].种子培养基:牛肉膏2g,CaC l 0105g,K 2H PO 42g,葡萄糖10g,M gS O 4015g,N aH 2PO 42g,去离子水定容至1L ,pH 712～714.斜面培养基:牛肉膏5g,蛋白胨10g,琼脂20g,NaCl 5g,去离子水定容至1L,pH 712～714.发酵培养基:葡萄糖10g,(NH 4)2S O 44108g,Na 2HP O 4115g,KH 2P O 43141g,MgS O 40171g ,CaCl 20103g,酵母浸粉011g,FeS O 4215×10-5g,CuS O 45×10-5g,ZnS O 4215×10-5g,用去离子水定容至1L,pH 712～714.113 生物表面活性剂产生菌的筛选11311 菌株的富集与分离取研磨好的样品1g,转入到99mL 无菌水中,振荡数分钟后,静置30m in .取静置后的上清 22 沈 阳 化 工 学 院 学 报 2009年液3mL,加无菌水定容至30mL.将上述所配制的30mL悬浮液各取10mL,分别加入到已灭过菌的盛有100mL富集培养基的250mL锤形瓶里面,设置3个重复,在37℃、150r/m in的条件下培养3～4d.取富集培养液012mL,均匀涂布在蓝色凝胶平板上,每瓶培养液设置3个平板.将培养皿倒置于温度为37℃恒温培养箱中培养2～3d,并随时观察菌落生长情况.挑选蓝色凝胶平板上变色圈较大的菌株在平板上划线纯化,挑取单菌落保存在斜面培养基上.11312 发酵培养将初筛得到的菌株转接于空白斜面,在37℃恒温培养24h后,接一环到灭好菌的种子培养基中,37℃、150r/m in振荡培养24h.取1mL种子液接种到液体发酵培养基中,并设置3个重复,在37℃恒温振荡器中振荡培养48～72h.114 排油活性的测定取培养皿,加水15mL,并滴加8mL液体石蜡,待形成稳定油膜后,加入1mL发酵液于油膜中心,设置3个重复,测定排油圈直径,取排油圈直径的平均值,以排油圈直径的大小来判断菌种的效果[10].用上述方法,加入1mL未接种细菌的发酵培养液,作为空白实验进行对比来判断复筛出的菌株的排油效果.115 菌株生长曲线的测定将种子培养液转接到发酵培养基中于37℃、150r/m in条件下培养,每间隔2h取样,在菌体最大吸收波长下测定培养液的吸光度,绘制菌体吸光度随时间的变化曲线,即为菌体的生长曲线.116 正交试验通过三次单因素试验,确定碳源、氮源的种类以及初始pH值的大致范围.在其基础上对影响生物表面活性剂合成的2个主要因子碳源和氮源的水平进一步优化.装液量和发酵时间这2种因素都能促使菌体的生长和繁殖.因此,在对发酵条件进行优化时,装液量和发酵时间也作为主要优化对象.正交试验以发酵培养基的碳源含量、氮源含量、装液量和发酵时间为研究对象,每个优化组合设置3个重复.因素水平设计见表1.通过极差分析评价各因子对表面活性剂合成的影响.表1 L9(34)正交试验因素水平Table1 Fact ors and levels of L9(34)orthogonal test因子水平装液量/mL发酵时间/h碳源含量/%氮源含量/% 1306010152507221153708432152 结果与分析211 菌株的筛选利用蓝色凝胶平板法从样品中分离出13株能产生生物表面活性剂的细菌菌株,经排油圈法复筛出排油圈直径达618c m的高产生物表面活性剂菌株WB.该菌株在普通细菌培养基上菌落透明,而在蓝色凝胶平板上的单菌落呈规则圆形,菌落中间突起呈草帽状,周围具有产糖脂类生物表面活性剂细菌的典型特征蓝色晕圈.经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudo m onas aeruginosa).212 生长曲线的测定将菌株WB种子培养液转接到发酵培养基中培养,于一定的时间间隔在560nm下测得培养液OD值.以OD值对应于时间绘制成WB的生长曲线,见图1.图1 菌株WB的生长曲线Fig.1 The gr owth curve of strain WB 由图1可知,接种后2h内是菌体适应新的环境和积累能量的阶段;在2～12h时间段里, 第1期 张 卉,等:产生物表面活性剂细菌的筛选及发酵条件优化23 曲线快速上升,说明培养液中菌体数量急剧增加,这一阶段为菌体的对数生长期;在12～24h 这段时间里,随着培养液中营养物质的消耗和代谢物的积累,细胞分裂速度减慢,生长曲线中出现“平台”,为稳定期;当达到24h 后曲线迅速下降,细胞死亡速度大于细胞分裂产生的新细胞的速度,部分死亡细胞解体,培养液中总菌体数下降,菌体进入衰亡期.213 培养条件的优化21311 碳源对WB 菌株发酵液排油活性的影响以葡萄糖、麦芽糖、石蜡、蔗糖、煤油为碳源,初始pH 为712～714,培养2d,测定菌株发酵液的排油活性,结果见图2.图2 碳源对WB 菌株发酵液排油圈的影响Fig .2 The effect of carbon res ourses on oildis persi on zone of WB br oth 图2表明,当以麦芽糖为碳源时WB 菌株发酵液的排油活性很好,同时测量发现,以麦芽糖为碳源的菌体生物量也最高.以葡萄糖和蔗糖为碳源时菌体的排油活性较好.而以煤油和液体石蜡为碳源时排油圈最小.21312 氮源对WB 菌株发酵液排油活性的影响以硫酸铵、麸皮、硝酸铵、尿素、氯化铵为氮源,初始pH 为712～714,培养2d,测定菌株发酵液的排油活性,实验结果见图3.图3 氮源对WB 菌株发酵液排油活性的影响Fig .3 The effect of nitr ogen res ourses on oildis persi on zone of WB br oth 由图3可知,当以氯化铵、麸皮和尿素作为氮源时菌株WB 发酵液的排油圈较大,表明以氯化铵、麸皮和尿素作为氮源有利于表面活性剂的合成.21313 初始pH 值对菌株WB 发酵液排油活性的影响以麦芽糖为碳源,麸皮为氮源,发酵液的初始pH 值分别调节为618、710、712、714、716,培养2d,测定菌株发酵液的排油活性,实验结果见图4.图4 初始pH 值对菌株WB 发酵液排油圈的影响Fig .4 The effect of original pH value on oildis persi on zone ofWB br oth 以不同pH 值对菌株WB 发酵液的排油活性的影响见图4.结果发现,以初始pH 为712时发酵液的浓度与排油活性两项指标都比较好.21314 正交试验正交试验以发酵培养基的碳源含量、氮源含量、装液量和发酵时间为研究对象,结果及分析见表2.表2 正交试验结果及分析Table 2 The results and analysis of orthogonal test 实验号A B C D 排油圈D /c m1111171321222412731333418342123619522116176233241737313231838321371793321513k 116141810321171913k 218133181671614712183k 316183141861313919143k 1/35147610171236143k 2/36111612251494128k 3/35161419541466148R119331818131616 由表2可见,仍以菌体排油圈直径为指标,发现当250mL 摇瓶装液量为50mL,发酵时间为72h,碳源质量分数1%,氮源质量分数 24 沈 阳 化 工 学 院 学 报 2009年215%时,能测得最大排油圈.经过优化,最终WB菌株表面活性剂的产量为316g/L.在单因素实验中发现麦芽糖作为碳源要优于葡萄糖,氯化铵作为氮源要略优于麸皮,但是在正交试验中选择葡萄糖做碳源,麸皮做氮源进行深入研究的原因是考虑到原料的成本,在生物制剂原料的价钱上看葡萄糖的成本价远远低于麦芽糖,而麸皮本身是农副产品,用麸皮做发酵原料不但降低成本而且很好地做到了废物利用,也为生物表面活性剂的工业化生产的实现提供了理论基础.3 讨论311 产生物表面活性剂菌株的快速筛选国内常用血平板筛选生物表面活性剂产生菌,但是由于血液在高温条件下既易变性又不能通过过滤除菌,因此存在不易灭菌、又容易引入杂菌的问题,影响筛选效果.针对这一问题,采用蓝色凝胶平板进行目的菌株的初步筛选效果较好.蓝色凝胶平板的主要特点是:可快速选出产表面活性剂的细菌,同时又抑制杂菌的生长,简化筛选过程,节约时间.通过对污泥中微生物群落进行初筛、分离、复筛发酵培养,测定发酵液是否产生排油圈,如果有排油圈则代表产生了生物表面活性剂,通过选取尺寸较大的排油圈,获得了几株较好的生物表面活性剂菌株.312 菌株产生物表面活性剂的判据测定生物表面活性剂产生的方法有表面张力法、排油圈法和发酵液乳化性能测定法等.排油圈法是较为常用的一种方法.表面活性剂浓度和活性与排油圈直径之间呈正比关系,观察排油圈直径大小,直径大于3c m的菌株保留做进一步研究.试验经过复筛选到的菌株其发酵液的排油圈均大于3c m,因此,这些菌株都具有较好的开发潜力,同时也证实设计的筛选培养基对于筛选生物表面活性剂菌株是有效的.313 发酵条件优化生物表面活性剂的合成和分泌,需要一定的环境条件[11].培养基的C、N、P浓度,pH值、离子强度等都对生物表面活性剂的合成有影响.而且当各种因素综合在一起时往往会出现与单因素实验不同的实验结果.通过单因素试验,初步确定了碳源、氮源的种类,初始pH值,继而进行正交试验对发酵条件进行进一步优化,确定了碳源含量、氮源含量、装液量和发酵时间.但是对发酵条件的影响绝不仅仅是这些,对其他条件的研究也是将来试验的研究重点.314 前景展望生物表面活性剂在环境保护、工农业和医药卫生等诸多方面均有广泛的用途.它具有生物降解和低度毒性等特点[12-13].但迄今为止,就经济效益而论,尚无法与市场上人工合成的化学产品相抗衡,为此还需做大量工作:(1)需改进微生物表面活性剂的生产工艺,降低生产成本;(2)加强菌种的遗传学研究,通过基因工程重组菌株,生产更有效的表面活性剂;(3)进行全面的毒理学实验,检验其安全性.参考文献:[1] B anat IM.B iosurfactants,M ore in D em and than Ev2er[J].B iofur,2000,20(198):44-47.[2] B urd G,W ard O P.B acterial D egradation of Polycy2clic A rom atic H ydrocarbons on A gar Plates:the R oleof the B iosurfactants[J].B iotechnol Tech,1996,10:371-374.[3] L in S C,G oursaud J C,K ram er P J,et al.P roductionof B iosurfactant by B acillus L ichenifor m is S train JF22[J].Eksevier 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The m ed ium for m ula and cultural conditions w ere op ti m ized,dextrose10g/L,w heat bran25g/L,yeast p ow der019g/L,the initial pH of m edium712,velocity of a shaking table at120r/m in and a250mL flask fed w ith50mL m edium and culture fo r a duration72hou rs.U nder the above conditions the b iosu r2 factant yield of W B w as316g/L.Key wo rd s: b iosurfactant; screening; op ti m ization of culture cond itions(上接第20页)Re sea rch on the Deco l o ri za ti o n of Dye i ng W a stewa te rs byMoul d Dh2B unde r Openi ng Conditi o nsL IU Gui2p ing1, W ANG J in1, L IU Chang2feng1, L IU Gui2juan2(11S henyang U n iversity of C hem ical Technology,Shenyang1101422,C h ina;21J ilin Zhenlai Technicians School,Zhenlai137000,C hina)Ab s trac t: The adsor p tion and decolo rization effect of acid pu r p le dye in an open system by m ould dh2B is discussed in th is paper including pH,initial concentration,tem perature and am ount of m ycelium pellets w ere also studied to m easu re/calculate/evaluate the i m pact of adsorp tion and deco lorization of dye in a non2sterile condition.The results show ed that36hours of bacteria develop ed w hen pH w as215,initial concentration of dyes w as50m g/L,the tem p erature w as30℃,the pellet w as215g/L(w et w eight)w hich had the best adsor p tion and decolorization effect.The decolorization rate reached95%after36hours.A lso, m old dh2B perfor m ed execellently w ith grow th trends in the capacity of develop ing m ycelium pellets.Key wo rd s: m old; biological adso r p tion; decolorization; dye satu rated w astew ater。
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生物表面活性剂产生菌株BYS6的分离筛选与鉴定门欣;沈卫荣;孙晓宇;韩丽萍;路鹏鹏;高怡文【摘要】5 biosurfactant producing-bacteria strains with development value were isolated from water and soil samples of water treatment station in Yanchang oil field by Hemolysis.Among them,BYS6 was the best biosurfactant producer,and the concentration of glycolip%采用延长油田水处理站水样和土样,血平板分离筛选到5株具有开发价值的生物表面活性剂产生菌。
其中1株表面活性剂产生菌株BYS6,摇瓶发酵后发酵液糖脂含量为4.73 g/L。
发酵液排油效果显著,排油直径〉6 cm,其产生的表面活性剂可将发酵培养基表面张力从69.9 mN/m降低至32.3 mN/m。
对菌株BYS6进行16S rDNA序列分析及系统发育学分析,鉴定为不动杆菌（Acinetobacter sp.）,GenBank登录号为HM132103。
通过TLC层析初步鉴定菌株BYS6的代谢产物为糖脂类生物表面活【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2011(000)015【总页数】3页(P19-20,25)【关键词】生物表面活性剂;产生菌株;分离;鉴定【作者】门欣;沈卫荣;孙晓宇;韩丽萍;路鹏鹏;高怡文【作者单位】陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043;陕西省微生物研究所,陕西西安710043【正文语种】中文【中图分类】TQ423;Q936生物表面活性剂（Biosurfactants）具有很好的亲水、亲油性能和界面优先分配能力，表现出很高的表面活性[1]。
它们在性能上与化学合成的表面活性剂非常相似，具有降低表面张力、稳定乳化液等特性，还具有无毒、可自然生物降解、生态安全及高表面活性和生理活性等优点[2-4]。
本研究采用延长油田水处理站的水样和土样，用血平板分离和排油活性检测的方法，从样品中分离筛选得到一株表面活性剂产生菌BYS6，在血平板上生长可产生明显溶血圈，排油活性稳定良好，16S rDNA序列分析鉴定该菌株为不动杆菌（Acinetobacter sp.）。
通过实验室摇瓶培养试验，探讨该菌株发酵产生的表面活性剂降低培养基表面张力的能力，同时利用TLC色谱初步鉴定了发酵产物。
1 材料与方法1.1 培养基配方分离培养基（血平板培养基）为：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉 0.1 g/L，NaCl 5 g/L，脱纤维绵羊血 8%；pH 值7.2～7.4。
摇瓶培养基：甘油 20 g/L，NaNO32.125 g/L，（NH4）2SO4 2.65 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，酵母提取物 1 g/L，pH 值为 7.2～7.4。
1.2 菌株的分离与培养试验样品来源于延长油田水处理站。
以血平板作为分离培养基，将样品按照平板稀释法分离，挑取可产生溶血圈的单菌落，反复纯化后保存于斜面。
将分离的菌株摇瓶发酵，在180 r/min、30℃条件下，振荡培养3 d，收集发酵液备用。
1.3 排油活性的测定取直径20 cm的培养皿，加入15 mL蒸馏水，再量取8 mL液体石蜡，倾倒于蒸馏水表面，静置30 min后，液体石蜡在水面上形成稳定的油膜。
吸取50 μL发酵液滴在油膜中央，稍等片刻，观察并记录不同菌株的发酵液的排油圈大小[5]。
选择排油圈＞3 cm的菌株作进一步研究。
1.4 表面张力的测定采用ZL-3型自动界面张力仪（山东博山同业分析仪器厂生产），将发酵液以4 000 r/min离心30 min后，去除菌体收集发酵液上清，以未接入菌种的空白培养基为对照，每一批发酵液均在23～25℃条件下用表面张力仪测量3次。
1.5 表面活性剂样品制备上清液用浓盐酸调pH值至1.5～2.0，发酵液中产生絮状沉淀，4℃静置过夜。
离心收集沉淀，pH值2.0的酸水清洗沉淀2次。
0.1 moL/L的NaOH溶液调pH值至中性，冻干后形成疏松状浅褐色固体，此为表面活性剂样品[6-8]。
1.6 TLC（薄层色谱）分析将样品溶于氯仿中，展开剂用氯仿∶甲醇（2∶1）。
显色剂：茚三酮显色剂（0.5%的无水丙酮溶液），脂肽显红色；苯酚硫酸试剂（5 mL浓硫酸溶于95 mL无水乙醇中，搅拌均匀后加入3 g苯酚），糖脂显棕色斑点；溴百里香酚蓝试剂（40 mg溴百里香酚蓝溶于0.01 moL/L NaOH 100 mL中），磷脂和类脂显蓝绿色斑点将预制板活化后，取出放在干燥器中备用；展开剂现用现配，静置30 min左右；将点好样的薄层板放置于层析缸中；样品展开到一定展距后，取出薄层板喷上显色剂，110℃烘箱中显色5 min[9]。
1.7 糖脂含量的测定苯酚溶液：称取重蒸苯酚10 g，加蒸馏水定容至200 mL，置于棕色瓶中备用。
鼠李糖标准溶液：取鼠李糖烘干至恒重，称取20 mg溶于蒸馏水，定容至200mL可得到浓度为0.1 g/L鼠李糖标准溶液。
分别取不同体积鼠李糖标准溶液溶于容量瓶，蒸馏水定容至50 mL，制备浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L的系列鼠李糖溶液。
分别取鼠李糖系列溶液各2 mL，以蒸馏水作对照，各加入1.0 mL苯酚溶液，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后于100℃水浴加热20 min，水浴后冷却至室温，于490 nm测量吸光度，绘制标准曲线。
取发酵液1 mL加蒸馏水定容至 100 mL，取此样品溶液2.0 mL，同上述方法测定，通过标准曲线换算出样品溶液中糖脂浓度。
1.8 菌种鉴定16S rDNA序列测定：将菌株BYS6于30℃、180 r/min培养2 d。
吸取1 mL培养液到EP管中，离心收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen），按照标准化步骤提取待测菌株的基因组DNA。
琼脂糖凝胶电泳验证提取结果。
以M13为引物，以全基因组DNA为模板，扩增待测菌株的16S rDNA段，琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果，片段大小约为1.5 kb。
将得到目的片段送测序公司测序，将测序结果于GeneBank数据库中做序列相似性分析，构建系统发育树，最终得到待测菌株BYS6的鉴定结果。
2 结果与分析2.1 分离菌株发酵液排油活性菌种发酵液的排油活性可作为一种直观的筛选方法，是检测菌种是否产生生物表面活性剂的重要指征。
本研究首先通过血平板法筛选出具有溶血圈的菌株29株，发酵液都具有排油活性，其中排油直径大于3 cm的菌株5株。
BYS6排油活性最强，排油直径＞6 cm。
2.2 发酵液表面张力经测定发现，未接入菌种的空白培养基的表面张力为69.0 mN/m，分离菌株的发酵液均能够不同程度地降低发酵培养基的表面张力，结果见表1。
由表1可知，菌株BYS6经过180r/min、30℃振荡培养3d后的发酵液，其表面张力为32.3mN/m。
由此可见，BYS6发酵过程中产生的表面活性物质可以将培养液表面张力降低50%以上。
表1 生物表面活性剂产生菌株的排油活性和降表面张力活性菌株编号排油直径∥cm 表面张力∥mN/m BYS6 6.2 32.3 BYS22 4.2 42.6 BYS30 5.3 38.2 BYS36 3.9 45.2 BYS70 3.5 43.82.3 表面活性物质TLC定性分析根据上述筛选结果，将BYS6作为生物表面活性剂产生菌株进行后续试验。
酸沉淀法提取表面活性剂样品作TLC分析。
结果显示，茚三酮显色后样品非红色，故该样品非脂肽类。
溴百里香酚蓝试剂显色，样品不呈现蓝绿色，故该样品非磷脂或类脂类。
苯酚硫酸显色后样品呈棕色斑点，可初步判断该样品为糖脂类。
2.4 糖脂含量测定糖基分子在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，与苯酚反应可以生成带色物质，在490 nm处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系，其灵敏度和特异性很高。
根据发酵液中糖的含量乘以相关系数3就可以得到糖脂的含量[10]。
本研究以延长油田水处理站的水样、土样为样源，采用血平板和排油圈测定法筛选到具有开发价值的表面活性剂产生菌BYS6，经液体发酵后测定糖脂产量达到4.73 g/L。
2.5 菌种鉴定采用16S rDNA序列分析确定菌株的分类学地位。
以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物进行PCR扩增，得到长度为1 421 bp的PCR产物。
菌株BYS6的16S rDNA序列GenBank登录号为HM132103。
与Genebank数据库中序列进行相似性分析，菌株BYS6与Acinetobacter calcoaceticus（AJ888983）的核苷酸序列同源性达到99%。
采用MEGA4.1软件包中的Neighbor-joining法构建系统发育树，结果见图1。
显示菌株 BYS6 与 Acinetobacter calcoaceticus（AJ888983）具有相隔最近的亲缘关系。
鉴定菌株BYS6为不动杆菌（Acinetobacter sp.）。
图1 生物表面活性剂产生菌BYS6系统发育树3 结论与讨论菌种筛选工作是生物表面活性剂及其相关研究的基础。
本试验从延长油田水处理站采取若干样品，构建血平板法和排油圈法筛选获得1株产生物表面活性剂的菌株BYS6，16S rDNA序列分析，该菌株为不动杆菌（Acinetobacter sp.）。
通过TLC（薄层层析）分析，初步鉴定该菌株发酵产物中的表面活性物质为糖脂类生物表面活性剂，摇瓶发酵培养后可将发酵培养基表面张力从69.9 mN/m降低至32.3 mN/m。
发酵液中的糖脂含量为4.73 g/L。
关于该产物的纯化方法以及具体结构有待进一步研究。
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