分子生物学笔记

分子生物学笔记中心法则（Central dogma）DNA的组成DNA的融解温度Tm，高GC含量使得DNA的Tm升高，以及GC的体积较小，使得测得密度较大DNA变性的条件:有机化合物,高pH,低盐浓度探针和DNA杂交基因组是一个生物体的所有遗传信息的集合。

染色体的组成：DNA、蛋白质、RNA组蛋白Histones：五种H1、H2A、H2B、H3、H4核小体核心由8个组蛋白组成H2A、H2B、H3、H4各两个（组蛋白八聚体）146bpDNA核小体核心+H1+linkerDNA组成了染色体组蛋白的修饰乙酰化：转录激活，结构变松散DNA复制半保留复制DNA聚合酶只能从5‘到3’合成DNA（前导链）2. 3‘到5’的DNA聚合酶移动是半不连续复制（后随链，也是从5’-3‘合成）冈崎片段（DNA+RNA引物），后随链绕DNA聚合酶一圈，使得两者的复制方向相同细菌的后随链片段约1000nt，真核细胞中约200nt3. 引物和模板依赖DNA聚合酶不能从头合成DNA，必须前面由10-12nt的RNA引物提供3’羟基引物酶在合成DNA前加上一小段RNA引物复制叉两条母链解开时形成复制叉（replication fork）拓扑异构酶（DNA旋转酶，gyrases）：去除DNA的超螺旋结构DNA解旋酶（DNA helicase）:DnaB作用以及DnaA、DnaC等其他蛋白质SSBP：单链结合蛋白，稳定解旋后的单链引物酶：合成RNA引物，需要引发体DNA聚合酶Ⅲ（原核）：同时合成两条链，链伸长DNA聚合酶Ⅲ：从5‘-3’合成DNA片段，然后删去RNA引物（具有核酸外切酶5‘-3’活性），发生缺口平移（缺口出现在引物和冈崎片段之间）DNA连接酶：去除引物后，连接冈崎片段和之前合成的片段滑动夹：保持DNA聚合酶不从DNA上掉下来端粒酶（telomerase）：DNA复制酶只能5‘-3’合成DNA片段，因此DNA两端5’的RNA引物去除后不能让DNA聚合酶Ⅲ生成替换RNA引物的DNA片段（末端隐缩）。

因此端粒酶自带RNA模板，先使用部分互补的RNA序列结合模板链的3'端，延长模板链，然后在模板链的增长部分合成引物，从而保证了DNA分子的长度。

（只有干细胞中端粒酶才具有较高的活性）端粒只在真核细胞染色体中存在。

DNA复制过程：在helicase 和topoisomerase的作用下复制叉在DNA上移动，单链被SSBP 固定。

leading strands 和lagging strands 都是DNA pol Ⅲ合成的，方向都是5'-3'。

冈崎片段的合成需要DNA pol Ⅲ，引物的合成需要Primase，引物的清除和切口平移需要DNA polⅢ，连接需要DNA ligase。

lagging strands是绕了一圈的，这样使得DNA polⅢ的两个亚基能在相同方向上催化DNA的合成3'-5'核酸外切酶（exonuclease）：从复制前端向5'端返回，从3'向5'去除错误的碱基复制起点：AT-rich区域+DnaA boxes端粒：DNA两端的重复序列DNA复制的几种方式双向复制：θ模型，真核生物可以多复制起点同时进行复制单向复制：原核滚环复制：环状DNA分子，置换出外面的链，σ model复制原点：ori复制子：从同一个复制起点开始复制的一段DNA序列在复制时DNA polⅢ具有3‘-5’核酸外切酶活性，可以修复影响构象的错误DNA的损伤和修复不是所有的DNA损伤都引起突变genotoxic：基因毒性，DNA的损伤积累到一定程度引起有害突变DNA损伤的类型烷化剂（alkylation）引起的碱基修饰，亲电，碳正离子紫外线引起的嘧啶二聚体（pyrimidine dimers）γ和X射线的损伤烷化剂是亲电子试剂，会亲电进攻G的N7，A的N3，其中A的N3被烷化影响更大例：EMS引发O6-甲基化GC->AT紫外线引起环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimers，CPD），相邻的TT的C原子形成环丁烷结构，阻止其与A的结合DNA修复系统1：direct repair，直接修复，完好如初例子：Photoreactivation，光修复CPDs紫外引起嘧啶二聚化，光修复酶（photolyase）使用蓝光到近紫外光切开TT 之间的环丁烷结构碱基烷基化：O6-甲基化通过自杀酶的巯基转移甲基修复（O6-methylguanine methyltransferase）DNA修复系统2：excision repair，剪切修复，三种类型先切除错误的片段，再进行修复BER（base excision repair，碱基切除修复）：切除碱基（DNA糖基化酶，DNA glycosylase），形成APsite（无嘧啶/嘌呤位点），再由AP核酸内切酶切开，磷酸二酯酶去除AP的脱氧核糖磷酸键，DNA聚合酶Ⅲ修复缺口，最后DNA连接酶连接缺口（大肠杆菌）。

NER（nucleotide excision repair，核苷酸切除修复）：对于较大范围的损伤修复，（大肠杆菌中uvrABC endonuclease，Excinuclease）核酸内切酶切除一段核苷酸（12-13nt），DNA聚合酶Ⅲ根据模板链进行修复，DNA连接酶修复缺口。

两种路径：GG-NER：global genome-NER，在基因组的任何位置修复TC-NER：transcription-coupled NER，RNA聚合酶进行修复，转录活性的基因3. Mismatch repair，错配修复总是切掉新合成的链，根据甲基化程度来判断母链DNA修复系统3：recombination repair，重组修复Homologous recombination是细菌中一个主要的修复过程当模板链出现严重损坏导致无法作为模板复制时，在将要复制的子链中形成缺口，通过和另一条模板链进行同源重组补上缺口，最后通过另一条的子链修复有缺口的另一条模板链，依赖于姐妹染色单体的存在，最终结果是有错误的那条模板链依旧没有被修复，但是复制后的子链是正常的DNA修复系统4：非同源末端连接（NHEJ）DNA双链损伤，强行将dsDNA的两个断端连接在一起DNA修复系统5: (damage) bypass mechanismSOS bypass（Error-Prone Bypass）错误倾向修复复制时不进行修复，产生的子链有很多的错误例：大肠杆菌接受UV处理，激活了RecA辅酶，裂解LexA，合成UmuC和UmuD蛋白质激活SOS通路2. Error-Free Bypass碰到嘧啶二聚体加上两个AHumans have relatively error-free bypass system that inserts dAMPs across from pyrimidine dimers真核生物处理dsDNA损坏的两种方法：同源重组修复，NHEJ非同源末端连接（在G1期发生，没有同源染色体可供配对时）转座子（transposons）和逆转录病毒（retrovirus）transposon：一段可以将自身或者自身复制插入与之无关的基因序列中的DNA序列retrovirus：一种可以将自身基因组逆转录成cDNA（provirus）插入宿主基因组中的RNA病毒基因组上的两类转座因子：retroelements(class I elements)：逆转座子，只在真核生物中，从RNA转录到DNA，需要一些逆转录酶(reverse transcriptase)，然后再整合到基因组中。

DNA-type elements (class II elements)：以DNA形式在基因组上传播，在原核生物和真核生物中都存在，自己编码了需要的酶(DNA polymerase or DNA gyrase)转座子的特点：两端有反向相同序列序列，插入后转座基因两端有相同的反向序列Direct repeat，编码转座酶切开基因组的时候，两端形成粘性末端，然后当作模板翻译形成Direct repeat 两类转座方式：复制黏贴和剪切黏贴，需要游离酶Resolvase两种类型：自主性转座子autonomous，编码蛋白用来转座nonautonomous 非自主性转座子，只有基因组里表达有同一家族的自主性转座子才能够转座玉米的转座子模型AS/DS细菌中的IS因子(Insertion Sequences)：反向末端序列，直接插入，不需要连接酶果蝇中杂种败育(hybrid dysgenesis)：P因子（卵细胞细胞质中有蛋白质可以抑制转座酶的活性）,所以只有P male × M female才会产生不育的后代。

可变剪接导致体细胞中的转座子失效，生殖细胞中的转座子激活导致不育provirus前病毒：是一段整合在基因组上的双链DNA逆转录病毒的基因组：逆转录酶（reverse transcriptase）、整合酶（integrase）基因组上的逆转录因子：LTR（长末端重复序列，来自逆转录病毒，但没有致病因子），LINEs(长散在重复序列，来自RNA 聚合酶Ⅲ的转录产物，自主转座)，SINEs(短散在重复序列，Alu element)Gag(Group Antigens) is a polyprotein 逆转录病毒的抗原集合转录转录产生和模板DNA序列(the coding strand, or nontemplate strand)相同的RNA链。

编码链（和mRNA序列一样），模板链（template strand）转录泡（transcription bubble)12~17bp，其上有DNA和RNA的杂交，杂交长度为8~9bpRNA polymerase：DNA-dependent RNA polymerasepromoter：启动子，在转录起始上游，RNA聚合酶的结合位点start point：转录起始点，RNA聚合酶开始转录RNA的第一个碱基的位置terminator：终止子，促使RNA聚合酶转录终止的DNA序列transcription unit：转录单元，在转录起始到转录终止之间的序列primary transcript：转录出的未经加工的mRNA，和转录单元相关upstream、downstreamRNA聚合酶（细菌）全酶：核心酶+σ因子核心酶：α2ββ'ω亚基。

α亚基可以和up element结合σ因子识别TATA box和启动子等序列。

起始因子β亚基延伸过程中需要，原核生物的β亚基可以被抗生素利福平或利福霉素特异性地抑制细菌的转录特点：转录可以和翻译同时进行，转录的特异性受到转录因子的控制细菌的基因簇（cluster）操纵子：Operon，一系列基因，包含结构基因和控制元件顺反子：Cistron，指结构基因，编码一个多肽是一个遗传单位多顺反子(polycistron)广泛存在于细菌中，可以同时转录出一系列功能类似的基因转录的三个阶段转录起始（Initiation），转录延伸（Elongation），转录终止（Termination）转录起始promoter上游序列：-10box TATAAT，-35box TTGACA在此区域的突变会影响RNA聚合酶在启动子上的结合从而影响转录活性，两者之间的距离在17bp时最好UP element 在核心启动子的上游，能够增强启动子的活性，和转录激活蛋白Fis有关转录起始点(Transcription Initiation site)：90%是嘌呤，且G多于A。