药用真菌金耳的rDNAITS序列分析与鉴别_刘春卉
基于rDNA-ITS序列的天门冬拟茎点霉与相似种的系统发育关系
基于rDNA-ITS序列的天门冬拟茎点霉与相似种的系统发育关系卢松茂;陈振东;林秀香;郑少缘;余智城【摘要】芦笋茎枯病由天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)引起,为明确P.asparagi与寄生在其他蔬菜、水果和经济林木等植物上的拟茎点霉不同种之间的系统发育关系,对分离至福建漳州的P.asparagi菌株及从GenBank 下载的相关菌株的35条ITS序列进行多序列比对分析,并用Neighbor-Joining法构建系统发育树.系统发育分析结果显示:35个菌株被划分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组群;P.asparagi与葡萄拟茎点霉(P.viticola)、叶下朱生拟茎点霉(P.phyllanthicola)、杨桃拟茎点霉(P.averrhoae)、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum)聚在Ⅰ组群的A亚群,它们的系统学关系最近;大豆拟茎点霉(P.longicolla)、大豆间座壳菌(Diaporthe sojae)、褐纹拟茎点霉(P.vexans)、光叶子花拟茎点霉(P.glabrae)、柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)、黄瓜间座壳菌(Diaporthe sclerotioides)聚在Ⅱ组群,它们与P.aspargi的系统学关系较远;昏暗拟茎点霉(P.obscurans)单独聚在最远的分支上(Ⅲ组群),其与P.aspargi的系统学关系最远.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(031)001【总页数】6页(P62-67)【关键词】天门冬拟茎点霉;拟茎点霉属;核糖体DNA内转录间隔区;分子系统学【作者】卢松茂;陈振东;林秀香;郑少缘;余智城【作者单位】福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001【正文语种】中文【中图分类】S644.6芦笋(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏，素有“蔬菜之王”的美称，富含多种氨基酸、蛋白质、维生素及人体所需的微量元素等［1］。
rDNA测序在酵母菌和丝状真菌鉴定中的临床应用评价
文章编号：1001-8689(2021)05-0432-05rDNA 测序在酵母菌和丝状真菌鉴定中的临床应用评价卢玲玲 单洪波 许育绚* 钟钰芳 丁进龙 王慧兰(杭州艾迪康医学检验中心有限公司 杭州 310000)摘要：目的 评价核糖体RNA(rDNA)测序，在临床酵母菌和丝状真菌鉴定中的应用价值。
方法 收集61株真菌(包括5株标准菌株，9株室间质评酵母菌，24株临床酵母菌，23株临床丝状真菌)，通过设计通用引物ITS 和26S D1/D2，对61株真菌进行PCR 扩增并对扩增产物进行双向测序，将获得的所有序列在Seqman 中打开，选取ITS 和26S D1/D2正反向序列无重叠峰片段，进行BLAST 核酸序列比对。
结合Mycobank 真菌分类信息以获得菌株鉴定结果。
结果 61株真菌全部扩增成功，剔除杂峰后，所有菌株联合ITS 和26S D1/D2测序鉴定，100%菌种能鉴定到属或群，97.0%(32/33)的酵母菌与73.9%(17/23)的丝状真菌准确鉴定到种。
结论 经优化后的核糖体RNA(rDNA)测序，能准确快速的鉴定临床常见真菌与疑难菌。
关键词：核糖体；真菌；基因测序中图分类号：R446.5 文献标志码：AApplication and clinical evaluation for DNA sequencing analysis in identification ofyeasts and filamentous fungiLu Ling-ling, Shan Hong-bo, Xu Yu-xuan, Zhong Yu-fang, Ding Jin-long, and Wang Hui-lan(Hangzhou Adicon Clinical laboratory, Inc., Hangzhou 310000)Abstract Objective To evaluate the value of ribosomal RNA (rDNA) sequencing in the identification of clinical yeasts and filamentous fungi. Methods 61 fungi were collected (including five standard strains of yeasts, nine strains of yeasts of external quality assessment, 24 strains of clinically isolated yeasts, and 23 strains of filamentous fungi), PCR amplification and two direction gene sequencing were performed by the universal primer 1TS and 26S D1/D2 of fungal rDNA gene. All sequences obtained were opened in Seqman, the fragments without overlapping peaks were selected for blast nucleic acid sequence comparison and were combined with Mycobank to obtain the information of species identification. Results All the 61 strains were amplified successfully. After removing the heteropeaks, all the strains were identified by combining with ITS and 26S D1/D2 sequencing. 100% of the strains could be identified to genera or groups, and 97.0% (32/ 33) yeast and 73.9%(17/23) filamentous fungi could be identified to species accurately. Conclusion The optimized ribosomal RNA (rDNA) sequencing could accurately and rapidly identify clinical common and difficult fungi.Key words Ribosomal; Fungus; DNA sequencing收稿日期：2020-05-08作者简介：卢玲玲，女，生于1984年，硕士，研究方向为临床微生物检验，Email:****************。
rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估
关键词 ： 内转 录间隔区 ； 因测序 ； 基 丝状真菌 ； 形态学鉴定
Ｅｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ＤＮＡ－ｎ ｅ ｎ ｌ ｔａ ｓ ｒｂ ｄ ｓ ａ ｅ ｅ ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｅｓ ｆ ｒ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｌ ｉａ ａ ｕ ｔｏ ｎ ｒ ｉ ｔ ｒ ａ ｒ ｎ ｃ ｉ ｅ ｐ ｃ ｒ ｒ ｇ ｏ ｓ ａ ａ ｇ ｔ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒ ｉ ｅ ｔ ａ ｉ ｆ ｃ ｉ ｃ ｌ ｉ ｆ ｏ ｎ
Ｔ ｅｆ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｌ Ｔ ｉ ｅ Ｂａ ｋ ａ ｔ — ｅ ｅ ａｉ ｇｓ ｓ ｍ ｒｐ ｙｏ ｅ ｅ ｉ ｔｅ ｎ ｏ ａ ａｉ ｅｉ ｄ ｃ ｔ ｒ ｗ ｓｈ ｌ ｆ ｌ ｏ ｈ ｃ ｉ ｆ ＡＳ Ｇ ｎ ｎ ｕ ｏ ｇ ｎ ｒｔ ｙ ｔ ｆ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ｒ ｅａ ｄ ｃ ｍｐ ｒ ｔ ｉ ａｏ ｓ ａ ｅ ｐ ｕ ｕ ｏ Ｂ ｎ ｎ ｅ ｏ ｃ ｖ ｎ ｔ ｄ ｔ ｒ ｎ ｈ ｉｈ ｈ ｍｏ ｏ ｏ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｓ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｕ ｄ ｂ ｏ ａ ｅ ｉ ｈ ｒ ｈ ｌ ｇｃ ｌｉｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ ｔｅ ｅ ｅｍｉ ｅ ｔ ｅ ｈｇ ｏ ｌｇ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ ． ｈ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｌ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗ ｔ ｔｅ ｍｏｐ ｏ ｏ ｉａ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｈ ｓ ｈ ｉ ｆ ｏ
ｃ ａ ａｔ ｎ Ｐ Ｒ）ａ ｐｉｃｔ ｎ ｎ ｈ Ｃ ｒｄｃｓｗ ｒ ｓｑｅ ｃｄ ａｄｃｍ ａｅ ｉ ｈ ａａｉ ｅＢ ｎ ． ｈ ｉ ｒ ｃｉ （ Ｃ ｎｅ ｏ ｍ ｌ ａ ｏ ，ａｄｔｅＰ Ｒ ｐｏｕｔ ｅｅ ｅｕｎ ｅ ｎ ｏ ｐｒｄｗｔ ｔ ｄｔ ｎＧ ｎ ａ ｋ ｉ ｆ ｉ ｈ ｅ
摘要 ： 目的 评价 内转 录间隔区（Ｔ ） ＩＳ 的多态性序列分 析（Ｄ Ａ ＩＳ序列分析 ） 临床少 见丝状真 菌的鉴定 ｒＮ — Ｔ 对 作用 ， 以形态学 鉴定方 法加 以补充验证 。方法 将 ３株待检 真菌通过 聚合 酶链 反应 （ Ｃ 扩 增和基 因测 序方法 Ｐ Ｒ）
基于香菇菌株rDNA—ITS序列的系统发育分析
ＹＡＮＧ Ｙｏ ｇｂｎ ＡＮ Ｊａｘ ，ＸＩ ｕ ｑ ａ ，Ｚ ｎ — ｉ ，Ｌ ｉ－ｉ Ｅ Ｆ — ｕ ｒ ＨＡＮＧ Ｋｏ ｇｊ ｔ ｎ － ｎ，Ｙ ｎ ｉ ＩＨｏ ｇ
（ ｕｉｎＰ ｏ．Ｃｒ ｏ ｓｒｏ ｅ ｎ１ ｘｅｓ ｎ ｕｈｕ３ ００ ） Ｆｊ ｒｖ ｔ ｒ ａ ．ｆ Ｍｕｈｏｍ Ｔｃ ｏ．Ｅ ｔ ｉ ，Ｆ ｚｏ ５０ ３ ｈ ｎｏ
ｃ ｍ ｐｅｔ ８Ｓ ｒ ｏ ｌ ｅ５． ＤＮＡ ，Ｉ ｅ ｕ ｎ ｅ ｒ ｂｔｉ ｅ ｄ ｕ ＴＳ ｓ ｑ ｅ ｃ ｓ ｗｅ ｅ ｏ ａ ｎ ｄ ａｎ ｓ ｂｍｉｔｄ ｔｅｍ ｏ ｔｅ Ｇｅ ｔｅ ｈ ｔ ｈ ｎＢａ ｋ Ｄａａ ｓ ｅ ｏ ｎ ｔｂａ ｓ ｆ ＮＣＢＩａｎ ｂ ｄｏ— ｒ ｉ ｄ ｒ ｇｓｅｅ ｕｍｂ ｒ Ｂａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｅ ｓ ｑｕ ｎ ｓ， ａ ｈ ｌｇ ｎｅｉ ｒ ｅ ｗａ ｏ ｓｒ ｃ ｅ ｂ ｅ ｌ ｙｎ ｒ ｇ ａ ｎ ａｎｅ ｅ ｉｔ ｒｄ ｎ ｅ． ｓ ｄ ｏ ｈ ｓ ｅ ｅ ｃｅ ｐ ｙｏ ｅ ｔｃ ｔｅ ｓ ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｄ ｙ ｍｐ ｏ ｉｇ ｐ ｏ ｒ ｍｓ ｉ
香 菇 （ ｅｔ ｕ ｄ ｄｓ Ｂ ｒ ） ｉｇ 是 仅 次 于 Ｌｎｉ ｓｅｏ ｅ （ ｅｋ Ｓｎ ） ｎ 双孢 蘑 菇 的世 界第 二 大 类 食 用 菌 ， 中 国食 用 菌 是 生 产 的一个重 要 组 成 部 分 ， 菇 菌 种 的 质 量 直 接 香 影 响着香 菇 的产量 和 品质 。福 建是 食 用 菌 生产 大 省 ， 中仅 ２ ０ 其 ０ ６年就 生产 食用 菌 １ １万 ｔ约 占全 ８ ， 国产量 的 １ ． ８ ， 中 出 口的 菌类 更 是 以 香 菇 ２２％ 其
利用ITS序列鉴定真菌
利用ITS序列鉴定真菌一、实验目的1，了解利用ITS序列鉴定真菌的原理；2，掌握用ITS序列鉴定真菌的方法步骤二、实验原理菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。
内转录间隔区ITS，位于18S和5.8S rDNA（ITS1）之间以及5．8S和28S rDNA之间（ITS2），ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8S RNA基因也被包括在ITS之内。
近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR 扩增、测序。
随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。
三、实验材料仪器用具：恒温水浴锅，移液器，离心机，核酸蛋白分析仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，PCR仪，离心管，微量移液器，枪头，一次性手套， PCR管 (0.2ml)；材料：金针菇试剂：1，基因组DNA提取试剂：氯仿-异戊醇(25︰1)；无水乙醇；蒸馏水；70%乙醇；TRIS饱和酚(pH 8.0) 提取液（Tris–HCl 1mol/L pH 8.0）2，特异性片段的PCR扩增试剂:MgCl2（25mM）；琼脂糖；DNA分子量标准物（100bp ladder）；10x缓冲液（Mg2＋free）；dNTP（10mM each）；Tag酶（5U/μL）；DNA模板；10μM引物：upper (31bp)；lower (30bp)3，ITS引物四、实验方法与步骤1，金针菇因组DNA的提取（TRIS 饱和酚一步法）。
⑴称取新鲜金针菇约0. 5 g ,置于洁净的小研钵中；⑵向研钵中直接加入1 ml TRIS饱和酚(pH值为8.0) 提取液,充分研磨至糊状；⑶用尖端剪除0. 5 cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到2 ml的离心管中,充分振荡约1 min ,随即加入0. 5 ml的氯仿-异戊醇(25︰1) ,轻轻振荡混匀；⑷将离心管于4 ℃,12 000 r/ min 离心10 min ,吸取上清于新离心管中,每管加入2 倍体积的无水乙醇,冰上放置10 min ；⑸4℃，12000 r/ min离心10 min ,弃上清；⑹沉淀用70 %乙醇漂洗2 次,超净工作台中吹干后,加50μl的蒸馏水溶解, - 20 ℃保存备用。
rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分类鉴定中的应用
析 及病原腐霉的诊断和 比较各种类 的亲源关 系上 ， 例如对群结腐 霉菌的鉴定 ．
３４ 其他 分子 生物 学技 术 的应 用 聚合酶链 式反应一 链构象多 态性分析 （Ｐ Ｒ ｓ ｃ ） ． 单 Ｃ — ｓ Ｐ是一 种有较高 开发潜力 的技 术 ，
目前在植物病原 菌分类鉴定 中用 的还 比较 少．Ｃ — Ｓ Ｐ Ｄ Ａ 指纹技 术 以及 Ｄ Ａ 直接测序 法一样有简单快 速的特点， Ｐ ＲＳＣ 和 Ｎ Ｎ
ｕ ｉ ｕ Ｔｏ ｈｍ ｍ ｒｗ的检 测 ．
３３ ＲＦ Ｐ 、 ． Ｌ ＲＡＰ 和ＡＦ Ｐ在腐霉分子研 究上的应用 限际性长度多态性 分析（Ｒ Ｌ ） 酶切 的方法对 Ｄ Ａ 进行 序 Ｄ Ｌ Ｆ Ｐ利用 Ｎ
列多态性分 析． 在真菌 的分类 鉴定 中，Ｒ Ｌ 技术主要用 于分析相似种 间的亲源关系及种 内变异性． ＦＰ 例如采用 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ — Ｆ Ｐ图
而 且更加经 济实 用 、 敏度会更 高， 是对于处 理大批量 的样 品时， Ｃ — Ｓ Ｐ比常规 Ｐ Ｒ更 有优势，只需要 一对通用 灵 尤其 Ｐ Ｒ ＳＣ Ｃ 引物就能够 同时对多个腐 霉种进行鉴 定． 对不 同的腐 霉菌株采用 ｒ Ｎ —Ｔ １ Ｃ — Ｓ Ｐ 析， 同的腐 霉种都有特 例如 Ｄ Ａ ＩＳ 的Ｐ Ｒ Ｓ Ｃ 分 不 征 Ｓ Ｃ 条带，利用 这一技术可将腐霉鉴定到种． ＳＰ 线粒体 Ｄ Ａ（ Ｄ Ａ） Ｎ ｍｔＮ 用于腐霉进化 和系统研究有 一定 的优势． 例如采用不 同种属 的腐霉 菌的细胞色素 Ⅱ（ＣＸ 基 因 Ｏ Ⅱ） 序列来研 究腐霉属的 系统 发育 关系 ； 利用线粒 体细胞色素氧化酶 Ⅱ基 因及间隔 区基 因序列分析 ， 把从形态特征上很难 区别 的菌株 区分 开． 目前 ｍ Ｄ Ａ 分 析方法在腐 霉的分子研 究上应用 还较少，将来通 过技术革 新， ｔＮ 有希望 在腐霉 Ｄ Ａ分 析鉴定 Ｎ
药用真菌金耳的rDNA ITS序列分析与鉴别
药用真菌金耳的rDNA ITS序列分析与鉴别
刘春卉;瞿伟菁;张雯;焦磊
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】2007(19)2
【摘要】研究了两个居群的金耳Tremella aurantialba以及近似品的rDNA ITS 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的ITS和5.8SrDNA完整序列,序列总长度为467～468,长度变异较少.聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支.ITS序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础.
【总页数】5页(P216-220)
【作者】刘春卉;瞿伟菁;张雯;焦磊
【作者单位】华东师范大学生命科学学院,上海,200062;华东师范大学生命科学学院,上海,200062;华东师范大学生命科学学院,上海,200062;华东师范大学生命科学学院,上海,200062
【正文语种】中文
【中图分类】R284.5
【相关文献】
1.中药当归及其混伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别 [J], 张春;王晓丽;朱烨;税丕先;庄元春
2.铁皮石斛及其混伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别 [J], 张蕾;邱道寿;蔡时可;邓瑞云;罗焕明;刘晓津
3.金耳与其近似种的rDNA-ITS序列分析 [J], 刘春卉;瞿伟菁;张雯
4.头似辐首线虫的形态观察及rDNA-ITS序列分析 [J], 胡丽莉;孙彦;张悦;卜艳珍
5.少毛钝绥螨的生物学特性及rDNA ITS序列分析 [J], 黄建华; 孙强; 杨迎青; 兰波; 李湘民
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金耳及金耳多糖的药用保健功效及其机理研究进展
Edible and medicinal mushrooms2021，29（3）：176～182金耳及金耳多糖的药用保健功效及其机理研究进展杨林雷1李荣春1,2*曹瑶1李梦杰1罗祥英1沈真辉1陆青青1（1.云南菌视界生物科技有限公司，昆明650200；2.云南农业大学食用菌研究所，昆明650201）摘要综述近几十年来有关金耳及金耳多糖的药理学和保健效果及其作用机理的研究进展，包括降血糖，调节免疫功能，增强机体抗氧化活性，保肝护肝，消炎止咳平喘，以及防治高脂血症、抗凝血、抗血栓和增强造血功能等；需要明确的是，用于获取金耳菌丝体多糖、发酵液和发酵液提取物这3种物质的生物材料是否为毛韧革菌。
关键词金耳；金耳多糖；药用价值；保健作用；效果；机理中图分类号：S646文献标识码：A文章编码：2095-0934（2021）03-176-07 Research progress on the pharmacology and health care effects ofNaematelia aurantialba and its polysaccharidesYang Linlei1Li Rongchun1,2*Cao Yao1Li Mengjie1Luo Xiangying1Shen Zhenhui1Lu Qingqing1（1.Yunnan Junshijie Biotechenology LCD,Kunming650200,China；2.Institute of Edible Fungi,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China）Abstract In this paper,the research progress of the pharmacology and health care effects of Naematelia aurantialba and its polysaccharides in recent decades had been reviewed systematically,including lowering blood sugar, anti-diabetic,regulating immune function,enhancing the body's antioxidant activity,protecting the liver,reducing inflammation,relieving cough and asthma,preventing and treating hyperlipidemia,anticoagulation,anti-thrombosis and enhancing hematopoietic function,and proposed that it is necessary to clarify whether the biological material used to obtain polysaccharide of mycelia of N.aurantialba,fermentation liquid and fermentation liquid extract is Sterem hirsutum.Key words Naematelia aurantialba;polysaccharides of N.aurantialba;medicinal value;health care effects;efficacy;mechanism金耳[Naematelia aurantialba(Bandoni&M.Zang)Millanes&Wedin][1]，俗称脑耳、金木耳、黄白银耳等，是我国极具特色的一种稀有珍贵食药用菌，隶属于银耳目（Tremellales）、耳包革科（Naemateliaceae）、耳包革属（Naematelia Fr.）[2,3]。
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【摘要】采集了四川马尔康地区3种真菌,根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱,初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种.为提高鉴定的准确性,通过构建基因池;用特异性引物进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序;将测得的实验样品的序列在GeneBank中进行BLAST比对;并与相似性较高的已知的种,利用DNA-MAN、Clustalx1.83和MEGA5.0软件采用N-J法构建进化树,探寻他们与已知物种的相关关系.结果表明,三种疑似菌株扩增出的目的条带为500-750bp,J1、J2、J3号菌株分别与臭黄菇、松乳菇、红菇的序列相似度最高.并利用序列的相似性做出了它们各自的进化树.最终得出结论:J1号菌株为臭黄菇(Russula foetens),J2号菌株为松乳菇(Lactarius deliciosus),J3号菌株为红菇(Russula.).利用rDNA-ITS序列分析法和形态学分类法相结合的方法鉴定菌种,不仅丰富了三种真菌的基因库,而且也克服了单纯的rDNA-ITS序列分析法因受基因库的完善程度、高度相似性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等限制而不能鉴定出所有真菌的缺点,提高了真菌分类鉴定中一些模糊性状的区分度.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】6页(P264-269)【关键词】真菌;鉴定;rDNA;ITS;PCR;测序【作者】朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】Q939.5传统的真菌鉴定方法主要通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验来鉴定。
rDNAITS序列分析在真菌鉴定中的应用
rDNAITS序列分析在真菌鉴定中的应用一、本文概述随着分子生物学技术的飞速发展，真菌鉴定方法也在不断革新。
其中，rDNTS序列分析作为一种高效、准确的鉴定手段，已经在真菌分类和系统发育研究中发挥了重要作用。
本文旨在探讨rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用，以期为该领域的研究提供有益的参考。
本文将首先介绍rDNTS序列的基本概念和特点，阐述其在真菌鉴定中的优势。
随后，将综述rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用现状，包括其在不同真菌类群鉴定中的应用案例、鉴定流程的优化以及数据分析方法的发展。
本文还将讨论rDNTS序列分析在真菌鉴定中存在的挑战与前景，如序列多态性、种间界限模糊等问题，并展望其未来的发展方向。
通过本文的阐述，读者可以全面了解rDNTS序列分析在真菌鉴定中的应用价值，掌握其基本原理和方法，为该领域的研究提供有益的参考和指导。
二、rDNAITS序列的基本结构和特点rDNA ITS序列，即核糖体DNA内部转录间隔区序列，是真核生物核糖体DNA中的一个重要区域。
该区域位于18S、8S和28S rDNA之间，由ITS8S rDNA和ITS2三部分组成。
其中，ITS1和ITS2是非编码区，序列长度在不同物种间存在显著差异，具有较高的可变性和种属特异性。
8S rDNA则是一段保守性较高的编码区，常用于序列的比对和定位。
高度多态性：ITS序列在种间和种内均表现出高度的多态性，这使得其成为真菌鉴定中非常重要的分子标记。
易于扩增：由于ITS序列的长度适中，且存在多个适合PCR扩增的保守区域，因此可以方便地从真菌基因组中扩增得到。
种属特异性：ITS序列的种属特异性使其在真菌鉴定中具有很高的分辨率。
通过比较不同物种的ITS序列，可以有效地鉴定到种或亚种水平。
进化速率适中：ITS序列的进化速率适中，既不过快也不过慢，这使得其既可以用于近缘物种的鉴定，也可以用于较远缘物种间的系统发育分析。
因此，rDNA ITS序列分析在真菌鉴定中具有重要的应用价值。
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天然产物研究与开发Na t Prod R es Dev 2007,19:216-220文章编号:1001-6880(2007)02-0216-05收稿日期:2006-06-19 接受日期:2006-08-28*通讯作者Te:l 86-21-62232019;E-m ai:l w i qn@b i o .cn药用真菌金耳的r DNA I TS 序列分析与鉴别刘春卉,瞿伟菁*,张 雯,焦 磊华东师范大学生命科学学院,上海200062摘 要:研究了两个居群的金耳T re mell a aurantialba 以及近似品的rDNA I T S 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的ITS 和5.8Sr DNA 完整序列,序列总长度为467~468,长度变异较少。
聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支。
I T S 序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。
关键词:金耳;核糖体DNA;ITS 序列;居群;近似品;DNA 分子鉴别中图分类号:R 28415文献标识码:ADNA M olecular Identification ofM edici nalM ushroo mTre m ell a auranti alba Based on I TS SequencesLI U Chun-hu,i QU W e-i ji n g *,Z HANG W en ,JI A O LeiSchool of L i fe Science ,East Ch i na N ormal University,Shanghai 200062,ChinaAbstract :The r DNA I T S sequences from t w o popu l a ti ons in Ch i na w ere stud ied and t hree analog species were discussed togethe r .The w ho le sequences o f r DNA I T S reg i ons (i nc l ud i ng I T S -1,5.8S and I T S -2)of T re m ella aurantialba w ere re -ported first ti m e .The resu lts showed that little difference i n length be t w een t he sequences w as f ound and the length w as 467bp and 468bp ,respec ti ve l y .T re m ella aurantialba and T re m ella auranti a for m ed a sepa ra te stable branch i n the t opo-l ogy trees ,wh ile T re m ella m esenterica c l ustered on another c l ade .The relati onsh i p bet ween t w o populations o f T re m ella aurantialba i n Y unnan and Shanx i prov i nces and T re m ella auranti a is c l osely related ,and they can rep l ace each othe r as the sa m e medic i ne acco rding to the rDNA I T S .T he character of I T S sequences can be used for prov idi ng t he mo lecu lar m arkers for i dentify i ng T re m ella aurantialba and explor i ng its gene ti c bas i s of f unga l sources .K ey word s :T re m ella aurantialba ;r DNA;I T S sequence ;population ;ana l og spec i es ;DNA m o l ecular i dentificati on金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳(Tre m ella auran tialba )的金黄色脑状子实体,为珍稀濒危真菌,民间对其药用历史悠久,5本草纲目6和陶弘景5名医别录6有记载,5中国药用真菌6述其主治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症[1-4]。
同属还有近似种金黄银耳Tre m ella aurantia Schw :Fr 、脑状银耳T re m ell a ence phal a Pers .、黄金银耳(与橙黄银耳同物异名)Tre m ella m esenterica Retz .:Fr .。
现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖,连续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[5],金黄银耳子实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平[6,7],黄金银耳子实体有较强的平喘作用[8],其多糖也有降低大鼠高血糖作用的报道[9]。
由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且易混淆,金耳种名一直被误定为Tre m ella m esen terica [10,11],原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪九十年代才得以确认并正式定名Tre m ella aurantial -ba B andoni et Zang [12,13]。
鉴于同属的近似品种较多,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别,同时近似种已有相似药理作用的报道,为防止品种源头混乱,保护种质资源,解析其它近似种的种质差异及可替代性,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行准确界定,不仅有助于规范资源的生产和保存,也可丰富生药资源库和数据库的基础信息。
通过检索GenBank 和E MBL 数据库,发现近似种金黄银耳Tre m ella aurantia 、脑状银耳Tre m ella encephala 、黄金银耳Tre m ella m esenterica 的r DNA I TS (核糖体内转录间隔区)序列均已注册,而金耳T re m ella aurantial -ba的I TS序列尚无录载。
真菌核糖体中的内转录间隔区序列的进化速率较快,可以提供较丰富的变异位点和信息位点,不仅广泛用于近缘属间、属内种间的分子系统学及鉴别,而且也被用于种内居群间的差异性研究,为此研究选择国内两个地域较远的金耳品种的r DNA I TS区碱基全序列作为分子标记进行测定,并结合GenBank收载的近似品的I T S序列进行分析,试图为金耳药材的种质鉴定提供分子依据。
1材料和方法1.1材料金耳T re m ella auran tialba子实体分别为9901产地为云南丽江(简称A13),9102产地为山西(简称A23,以下括号内均为简称),由瞿伟菁教授鉴定。
GenBank收载本研究引用的其它银耳属真菌及其GenBank登录号如下:金黄银耳Tre m ella aurantia AF444315(Ta)、脑状银耳Tre m ell a encephala AF410474(Te1),AF042404(Te2),AF042402(Te3)、黄金银耳Tre m ella m esenterica AF042448(Tm1), AF042443(Tm2)、银耳(白木耳)Tre m ella fuci f or m is AF444316(T f)。
1.2总DNA提取总DNA提取基本依照氯化苄法[14]略加改进,步骤如下:收集消毒供试子实体各0.1g,加0.5m L 提取液(0.1m ol/L T risH C,l p H9.0和0.04mo l/L EDTA,p H8.0)研磨混匀,加0.1mL10%SDS和013mL氯化苄充分混匀,50e保温1h,加0.3m L3 m o l/L N a OA c(p H5.2)混匀,冰水浴15m in,6000 rpm室温离心15m in,取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20m i n,去上清,10000rp m室温离心15m i n,沉淀用70%乙醇洗一次,风干后水溶,4e保存, 1.5%Agrose琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30m in)检测纯度和分子量范围。
1.3r DNA I T S区的扩增、纯化和测序采用双向PCR反应扩增I TS1-5.8S r D NA-I TS2整个片段,用18S r D NA3c端引物作上游引物I TS1: 5c-CGTAAC AAGGTTTCCGTAGG-3c,用28S r DNA5c 端引物作下游引物I T S4:5c-TCC TCCGCTTATT-GATATGC-3c。
反应体系(50L L)含:模板:5@10-9 g,引物I TS1和I T S4(2@10-5m o l/L)各1L L,10@ PC R缓冲液(p H8.3)5L L,dNTP(0.01m ol/L)4 L L,Taq酶(5U/L L)0.25L L(引物和M arker购自上海生工,Taq酶和dNTP购自大连宝生物公司),灭菌双蒸水定容至50L L,加好后上盖石蜡油25 L L。
扩增条件:94e预变性5m i n,94e1m i n,55 e45s,72e1m i n,循环30次,72e延伸5m i n,产物于4e保存。
Agrose琼脂糖凝胶电泳检查产物(M ar ker分子量范围100~1200bp),产物纯化回收(北京鼎国公司PCR产物试剂盒),每样平行重复5次,纯化后的产物以与PCR相同的引物双向直接测序(华大基因上海鼎安公司完成)。
1.4序列分析用DNAStar(DNAStar,I nc.1996)软件包编辑, C l u sta lW对位排序,在线BLAST检索,从Genbank 中提取其它相关真菌的I T S序列,用M ega2.0分子进化遗传分析软件,选择药性较近的药用菌木耳Auriculari a auricular AF291268(A a)作为外类群[1,15],统计和分析序列的变异情况,采用系统学分析软件PAUP4.0中的邻接法(ne i g hbor-j o ining m ethod,N J),最大简约法(m ax i m um parsi m ony m et h-od,M P)和最大似然法(m ax i m um li k elihood m ethod, ML)推测系统关系。