生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology课件
生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology
鉴 定 所 提 取 总 RNA 分 子 的 质 量 ， 可 以 通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得 28S、18S条带来判断。
Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma
其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的 激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活 性。
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
二、真核细胞染色体DNA的制备
掌握真核生物基因组DNA的提取的 基本原理。
提取高质量基因组DNA的主要析
真核细胞染色体DNA的制备过程
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
rRNA在总RNA分子中含量最丰富 ，由28S、 18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大， 分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分 子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子 交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在 细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白 及 有 些 组 蛋 白 mRNA 以 外 ) ， 均 在 3’ 端 存 在 20250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可 很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分 离mRNA。
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
教学要求
通过教学，要求学生掌握分子生物学与基因工程的 基本理论，巩固所学的理论知识；
生物工程综合性实验名词解释
1.fermentation(发酵)：利用生物细胞（含动植物、微生物)，在合适条件下经特定的代谢途径转变成所需产物菌体的过程。
2.fermentation engineering(发酵工程)：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞(包括动植物、微生物)参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。
3.bioengineering(生物工程)：以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程，机械工程，控制工程，环境工程等工程科学，研究或发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程科学。
广义上说是指运用生物科学知识及工程学的原理，开发利用生物材料为人类社会提供产品和服务的工程技术。
狭义上是指以基因工程技术为核心的现代生物技术的总称4.biocatalyst(生物催化剂)：指传统发酵所利用的微生物外，还包括现在生物技术所利用的动植物细胞或细胞中的酶5.isolation of strain(菌种分离)：根据生产要求和菌种特征性采用各种不同的筛选方法从众多的杂菌种分离出所需的性能良好的纯种6.Strain breeding (菌种选育)：从分离筛选获得的有价值菌种中经过人工选育出各种突变体以大幅提高了菌种产生有价值的代谢产物的水平，改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新代谢产物7.Nature breeding(自然选育)：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程8.Mutation breeding (诱变育种)：利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学因素试剂处理微生物细胞提高基因突变率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质植株9.Cross breeding(杂交育种)：通过杂交方法，将不同植株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷10.Culture preservation/maintenance of culture(菌种保取)：根据菌种的生理生化特点，人为创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异11.Growth factor(生长因子)：具有刺激细胞生长活性的因子。
学科综合实验报告
实验名称：现代生物技术综合实验实验目的：1. 理解并掌握现代生物技术的基本原理和方法。
2. 学习和运用PCR技术、DNA测序和基因克隆等现代生物技术。
3. 培养团队协作能力和科学实验操作技能。
实验时间：2023年3月15日实验地点：生物技术实验室实验器材：1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、DNA测序仪、离心机、恒温培养箱等。
2. 实验试剂：DNA模板、引物、PCR试剂、DNA测序试剂、质粒提取试剂盒等。
3. 实验材料：大肠杆菌、酵母菌、植物组织等。
实验步骤：一、PCR扩增1. 设计引物：根据目的基因序列，设计一对特异性引物。
2. PCR反应：将DNA模板、引物、PCR试剂混合，进行PCR反应。
3. PCR产物检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
二、DNA测序1. DNA提取：从实验材料中提取DNA。
2. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。
3. DNA测序：将纯化的DNA进行测序，得到目的基因序列。
三、基因克隆1. 质粒提取：从大肠杆菌中提取质粒。
2. 质粒纯化：使用质粒纯化试剂盒进行质粒纯化。
3. 酶切连接：将目的基因和载体进行酶切连接。
4. 转化：将连接产物转化到大肠杆菌中。
5. 阳性克隆筛选：通过PCR或DNA测序筛选出含有目的基因的阳性克隆。
实验结果与分析：一、PCR扩增结果通过PCR扩增，成功得到目的基因片段，大小与预期相符。
二、DNA测序结果通过DNA测序，得到目的基因的核苷酸序列，与预期序列一致。
三、基因克隆结果通过阳性克隆筛选，成功克隆出目的基因，并将其表达在酵母菌中。
实验讨论：1. PCR技术在基因克隆和基因分析中具有广泛的应用，其灵敏度、特异性和快速性使其成为现代生物技术中的重要工具。
2. DNA测序技术可以精确地测定目的基因的核苷酸序列，为基因功能研究和基因工程提供重要信息。
3. 基因克隆技术是实现基因表达和蛋白质纯化的关键步骤，为生物制药、基因治疗等领域提供了有力支持。
生物学教育综合试验
生物学教育综合实验Comprehensive Experiment of Biological Education【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课【学分数】4学分【适用专业】生物科学【学时数】 128学时【编写日期】 2009年6月一、教学目标本课程是在生物化学、发育生物学及现代生物技术等理论课的基础上，开设的一门基础性兼综合与设计性实验课。
该课程的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的生化、发育生物学及现代生物技术等领域的研究技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验，一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生学会现代生物技术常规的仪器设备及部分大型仪器设备的使用，并进一步培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力，提高学生从事科学研究的综合素质。
二、教学内容和学时分配实验一、实验总论4学时基础性主要内容：课程设计思路简介，实验准备（清理仪器、配置试剂等）。
教学要求：了解生物学教育综合实验课的目的与要求、评分标准及仪器操作要求。
重点、难点：理论学习与试剂的配置。
实验二、碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定28学时综合性主要内容：大肠杆菌单菌落碱性磷酸酶的诱导表达，菌体收集和超声破碎，分离纯化碱性磷酸酶（离子交换层析法、硫酸铵沉淀法和分子筛层析法），样品的浓缩与保存、分离纯化参数的测定、分离纯化过程的提纯倍数与回收率的确定以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
教学要求：了解蛋白质分离纯化的基本过程；理解蛋白质分离纯化重要技术（原核表达、离心、细胞破碎、沉淀法、离子交换层析、透析）的原理与应用范畴以及蛋白质浓度和酶活力的原理；掌握蛋白质分离纯化基本技术（原核表达、离心、细胞破碎、沉淀法、离子交换层析、透析）的操作方法，蛋白质浓度及酶活力测定法的操作方法，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法，离心机、超声破碎仪、恒流泵、核酸/蛋白检测仪、记录仪、部分收集器以及分光光度计的使用方法。
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。
γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。
GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。
实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1. 了解真核生物RNA提取的原理；2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
二、实验原理Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。
TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。
三、实验材料1. 材料甘薯叶片，品种为徐薯182. 试剂①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；② Trizol试剂；③氯仿；④异丙醇、75％乙醇；⑤ TBE缓冲液；⑥上样缓冲液3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP 管架四、实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；6. 室温放置10 min晾干沉淀；7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。
《生物技术综合实验》教学大纲
《生物技术综合实验》实验课程教学大纲课程名称(中文) 生物技术综合实验课程名称(英文) Comprehensive Experiments of Biotechnology课程编号33101105课程类型专业必修课教材名称《生物技术综合实验指南》（陆勇军等）自编教材是否独立设课是√否学时学分:总学时 108 总学分 3 实验学时108实验学分3开出时间：四年级第十学期适用专业生物技术专业、生物技术及应用专业、逸仙班先修课程《生物化学》、《生物技术学》、《微生物学》、《遗传学》备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课一、课程简介及基本要求本课程是一门综合性实验课程。
要求学生在掌握生物化学、生物技术学、微生物学和生物化学技术原理等的基础上，学习和掌握生物技术实验的基本原理和技术，主要包括基因工程常规操作（如从生物材料中提取功能基因、再把该基因克隆到载体DNA上。
然后转化至细菌或酵母中进行表达等）技术及一系列生物大分子的提取（包括从微生物、动物或植物材料中提取）、分离、纯化的方法和技术。
了解并掌握各种常规生化仪器及发酵器材的使用和保养；培养和训练学生具有良好的科研素质、有较强的分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。
二、课程目的及要求1.通过实验综合运用各门理论课相关知识，并加深理解。
2.培养学生实事求是的科学品德、团结合作的科学工作精神、善于思考和分析、解决问题的能力，全面提升他们的科研素质，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。
3.要求学生课前做好预习，熟悉每个单元实验的原理和方法，也可根据自己的理解和兴趣，设计相关研究实验。
4.实验过程中，要求学生掌握各种常规生化仪器及发酵器材的规范操作。
实验室实行开放式管理，以小组形式独立自主完成实验。
三、适用专业生物技术专业、生物技术及应用、逸仙班四、主要仪器设备紫外及可见分光光度计、电泳仪及电泳槽、（高）低速离心机、电子天平、电热恒温水浴箱、干燥箱、冰箱、高压灭菌锅、恒温摇床、PCR仪、超净工作台、酶标仪、蛋白纯化系统、凝胶图像分析系统、各种规格的微量进样器等。
生物技术大实验
生物技术大实验北京师范大学生命科学学院井健生物技术实验课的确立一、生物技术实验课的重要性二、我校生物技术实验课的特色三、我校生物技术实验课如何与其他实验课程衔接四、我校生物实验课的安排内容生物技术Biotechnology利用生物(动物、植物或微生物)或其产物来生产对人类医学或农业有用的物质或生物。
传统生物技术：酿造发酵配育新种现代生物技术：以生物化学或分子生物学的操作方法，来改变生物或其分子的(遗传) 形质，以达上述目的。
以新的技术来解决已有的问题课程特色综合性：多种研究对象、多个技术方案、多类实验方法、多层次研究内容实用性：面向科研实际、面向生产实践系统性：完整研究方案的雏形先进性：力求把先进的生物技术、方法引入到教学领域，反映科学研究前沿生物技术实验课的确立领导的支持：•北京师范大学生命科学学院生物化学及生物技术系主任魏群教授；•北京师范大学生命科学学院副院长桑建利教授；•北京师范大学生命科学学院院长葛剑平教授；•北京师范大学教务处副处长方瑾教授；生物技术实验课的开展•指导教授：魏群教授•植物基因工程部分：肖尊安；•细胞工程、发酵工程、酶工程等部分：马晴、井健；•中心实验室：鲍蕾、戴中心。
课程开设对象生命科学学院：•生物技术专业大学四年级上学期本科生；•一年级硕士研究生；•外校进修教师；前期参加的实验课程•微生物学实验，大学二年级下学期；•分子生物学大实验（北京市精品课程，现申报国家精品课程），大学三年级上学期；•生物化学大实验，大学三年级下学期；•细胞生物学实验，大学三年级下学期；理论课程前期学习的主要理论课程：生物化学；分子生物学；基因工程；蛋白质工程；微生物学；细胞生物学；同时开设的课程：分子酶学；发酵工程；课程开设目的一、加强实验课程的综合性训练，进一步提高学生的工作能力；二、开拓学生眼界，了解现代生物技术知识；三、为学生将来从事具体的科研与实际工作打基础。
实验课程内容安排一、植物基因工程二、细胞工程三、发酵工程四、酶工程五、免疫技术六、双向电泳技术一、植物基因工程1、烟草叶片愈伤组织的诱导与器官发生2、农杆菌转染与共培养3、原生质体的分离与培养4、体细胞融合和杂交5、转基因烟草的筛选与鉴定二、细胞工程1、利用昆虫细胞进行溶栓蛋白的瞬时表达2、利用Hela细胞结合荧光显微技术观察gfp基因及gus基因的表达三、发酵工程1、固体发酵法制备柠檬酸的实验2、液体发酵法制备链霉素的实验3、基因工程制药技术四、酶工程1、利用Al2O3固定化酶技术制备 -半乳糖苷酶的固定化载体并测定酶学性质变化2、利用其他技术制备固定化酶五、免疫技术1、单克隆抗体技术2、免疫扩散-电泳检测技术3、酶联免疫吸附技术六、双向电泳技术1、双向电泳技术2、双向电泳技术的应用总结与讨论1、对现代生物技术的认识2、现代生物技术在科研与生产实践中的应用3、设计实验课程参考文献•生物工程技术实验指导，魏群主编，北京：高等教育出版社，2002年。
现代生物技术综合实验PPT课件
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15) 每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝
胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
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在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大， RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此， 可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样 品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
DNA的完整性； 14. 利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。 15. （方法同实验二）
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六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
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实验四 PCR反应
一、实验目的
了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
10 × PCR buffer
5μl
dNTP mixture 前向引物 (P1) 反向引物 (P2) DNA 模板
rTaq酶 灭菌蒸馏水
4μl 8μl 8μl 0.5μl 0.5μl 24μl
所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，
为了防止反应混合液蒸发，可添加30μl矿物油覆盖。
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(4)弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，然后加 人10ml用冰预冷的0.1mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置 于冰上10分钟。
(5)4000rpm/min，4℃离心10分钟回收细胞，弃上清，每 50ml的原培养物再加入2ml冰冷的0.1mmol/L CaCl2溶 液，悬浮细胞。
Paul Berg
Herb Boyer
1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced the first recombinant
DNA molecules.
They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA",
DNA
克 隆 外 源 基 本 流 程 图 示
2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 （1）分离制备待克隆的DNA片段； （2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接； （3）重组DNA分子转入宿主细胞； （4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；
2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 （1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然 后分离所需要的DNA片段（原核基因）； （2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反 转录合成cDNA（真核基因）； （3）用化学法人工合成DNA。
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944） 2.DNA结构双螺旋模型 (Watson & Crick, 1953) 3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg
2.2.2 DNA的连接
限制性内切酶处理DNA后，一般产生粘性末端、 平末端两种形式。 两个DNA片段有以下几种出现方式： ①两个不同的粘性末端； ②两个相同的粘性末端； ③一个粘性末端一个平末端； ④两个平末端。 注意：提高连接效率、降低假阳性！
2.3 重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞
受体细胞也称宿主，是重组子扩增及表达的场 所，分为原核细胞和真核细胞两类。 ➢ 原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌 等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所， 也可以作为外源基因的表达系统）。 ➢ 真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞 等。
& Crick ） 4.发现反转录酶(Baltimore & Temin, 1970) 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究
(Lederberg, 1950-1970) 6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，
Smith和Nathans） 7. DNA体外重组（ Cohen等，1973）
(3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作， 同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。
(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和 阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基 因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。
(5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的 启动子、信号肽序列、 SD顺序、加尾信号、增 强子等调控元件。
(1)将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16— 20小时。
(2) 从 平 板 中 取 出 1 个 2-3mm 大 小 的 单 菌 落 ， 移 至 含 100ml LB 培 养 基 的 500ml 三 角 瓶 中 ， 37℃ 280rpm/min强烈振荡培养3小时，使细胞的浓度达到 对数生长期或对数生长前期，细菌的OD.600一般在 0.2—0.4之间。
在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有 两个概念： ➢转化(transformation or introduction)：特 指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细 菌的过程。 ➢转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以 它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）: 操作步骤 ( protocol)：
宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一 个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。
2.2 靶DNA片段与载体的连接 2.2.1 载体的选择与改造应具备下几个条 件： (1)载体上应具备完成实验目的的最基本元 件：如载体上应具有适当的启动子、终止 子等。
(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的 DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位 点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取 代该区段，形成的重组子座里程碑的树起，凝聚着几代科学家 的心血与努力，他们在理论与技术上的卓 越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的 基础。
一、基因克隆的策略与技术路线 1.基因克隆的策略
克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细 胞组成的群体的过程。
在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基 因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子 与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主 复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前 基因克隆的主要策略。
(6)按每份200ul分装细胞，若不马上进行转化，该感受 态 细 胞 可 以 加 入 终 浓 度 为 10 ％ 的 灭 菌 甘 油 ， 置 于 70℃冻贮。
转化( transformation)： a．用新鲜制备的（或从-80℃冰箱中取出置冰上5
分钟至刚好解冻的）感受态细菌100μl感受态 细菌至预冷管中。 b．加入1-50ng DNA，用微量移液器吸头搅动两次， 以便DNA扩散均匀，用手指弹动管壁数次。 c．马上放置冰上30分钟。