生物技术综合大实验
生物技术专业综合实验独立设课的实践与思考
第7期岳慧英，等:生物技术专业综合实验独立设课的实践与思考185・生物技术专业综合实验独立设课的实践与思考岳慧英，吴娜，蔡东晖，胡丽丽*（山西中医药大学基础医学院，山西晋中030619）摘要:生物学以理论研究为基础，是一门实践性很强的学科，提升学生的综合实验技能对创新型人才的培养有重要的促进作用。
对生物技术专业独立设置《生物技术综合实验》实验课，实验内容包含基因工程、细胞工程、发酵工程和蛋白质工程四个模块，实验项目设置以综合性实验为主，考核方式中加入了科技论文写作，学生参与科学研究的全过程，提高了综合素质。
通过《生物技术综合实验》独立设置实验教学实践，取得了良好的教学效果，增强了本科生的自主学习、主动思考、分析问题、解决问题的能力，为培养生物科学创新型人才奠定基础。
关键词:生物技术专业；生物技术综合实验；独立设置实验课中图分类号：G642.0文献标识码：B文章编号：'008-02'X（202'）07-0'85-02随着当今生物技术产业的蓬勃发展，对生物专业人才的专业素质要求不断提升。
生命科学领域的发展要求生物技术本科毕业生不仅具有较扎实的生物技术基础理论知识，更强调具备较强的实验技能、动手能力以及独立分析问题和解决问题等综合科研能力。
当今时代技术发展要求大学素质教育与创新创业相结合的背景下，对生物技术专业实验课程的教学模式和实验内容进行改革大有必要，以适应形势发展的要求。
山西中医药大学（以下简称“我校”）基础医学院生物技术专业为四年制本科,为学生开设了遗传学、细胞生物学、生物化学、分子生物学、发育生物学、微生物学等专业课程，且上述理论课中均设计有紧扣理论的实验课，目的是用理论知识指导实验实践，并在实验中加深对理论知识的理解。
在第6学期，为学生开设了生物技术概论,该课程是一门实践性、综合性很强的学科，包括基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程和酶工程中重要理论和技术的概述，重在突岀五大工程在农业、食品、工业、医学、药学等方面的综合应用，所以该课程理论课后安排有一定学时的实验课。
生化实验技术-综合设计性大实验
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物 质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件 下容易变性？
原料选择和预处理
选什么样的原材料应视生产目的而定。 一般要注意以下几个方面:
1．要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．成本比较低； 5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择
蛋白质类生化产品的原料来源有动植 物组织和微生物等，原则是要选择富含所 需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提 取的无害生物材料。
实验实施要求：平时按各组计划时间分 别进行实验，组长有义务指导下组相关 实验内容，每次实验必须登记。
全班交流：实验结束安排课堂讨论交流， 每组准备一人汇报，一人记录；要求用 PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难 点，其他组学生质疑，教师点评。
指导教师：汪财生、斯越秀
实验项目训练目标
12实验目标?掌握免疫球蛋白igg的原理和方法?掌握利用紫外法单向免疫扩散法等测定igg含量的方法?掌握sdspage电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法?掌握层析透析膜分离电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作13实验要求掌握的技术柱层析分离技术sephadexg25分子筛层析deaecellulose离子交换层析蛋白质提取技术硫酸铵盐析透析膜分离技术等蛋白质含量测定消光系数法folin酚法测定igg蛋白质含量蛋白质分子量纯度活性测定sdspage电泳法检测单向免疫扩散法猪脾脏dna提取及含量鉴定实验二21内容提要为了研究dna分子在生命代谢中的作用常常需要从不同的生物材料中提取dna
生物技术实验报告
生物技术实验报告生物技术实验报告引言生物技术是一门涉及生物学和工程学的交叉学科，通过利用生物体的特性和生物分子的相互作用，来解决现实世界中的问题。
本实验旨在探索生物技术在实验室中的应用，以期增进对生物技术的理解和认识。
实验目的本实验的目的是通过使用PCR技术，对特定基因片段进行扩增，并通过凝胶电泳分析扩增产物。
通过这个实验，我们将学习PCR技术的原理和操作步骤，并了解如何使用凝胶电泳进行DNA分析。
实验材料和方法材料：- DNA样本- PCR试剂盒- 扩增引物- DNA电泳仪- 琼脂糖凝胶- DNA标记物方法：1. 准备PCR反应体系：将PCR试剂盒中的反应液与DNA样本、扩增引物混合。
2. 进行PCR扩增：将混合好的反应液放入PCR仪中，按照设定的温度和时间进行扩增。
3. 准备琼脂糖凝胶：将琼脂糖溶解在缓冲液中，倒入电泳仪中，等待凝固。
4. 准备样品：将PCR扩增产物与DNA标记物混合。
5. 进行电泳：将混合好的样品倒入琼脂糖凝胶槽中，进行电泳分析。
6. 分析结果：观察凝胶上的DNA条带，判断扩增是否成功。
实验结果与讨论在进行PCR扩增和凝胶电泳后，我们观察到在琼脂糖凝胶上出现了一些DNA 条带。
这些条带代表了PCR扩增产物的大小和数量。
通过比较这些条带与DNA 标记物的迁移距离，我们可以确定PCR扩增产物的大小。
在实验中，我们使用了PCR技术对特定基因片段进行扩增。
PCR技术通过利用DNA聚合酶酶的特性，在不断变化的温度条件下，使DNA链的两端进行反复扩增。
这种扩增过程可以快速产生大量目标DNA片段，从而使我们能够对其进行进一步分析。
凝胶电泳是一种常用的DNA分析方法，通过利用DNA的负电荷特性，在电场的作用下，使DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移。
由于DNA片段的大小不同，迁移速度也不同，因此在凝胶上形成了不同大小的DNA条带。
通过与DNA标记物的比较，我们可以确定PCR扩增产物的大小。
在本实验中，我们成功地扩增了目标基因片段，并通过凝胶电泳分析得到了相应的结果。
生物技术制药综合实验的探索与实践
生物技术制药综合实验的探索与实践生物技术制药是一门跨学科的领域，涉及生物学、化学、药学等多个学科的知识，其核心在于利用生物技术手段生产药物。
生物技术制药的发展和应用，已经成为推动医药产业发展的重要引擎。
本文将从实验的角度出发，探索生物技术制药的实验方法和实践经验，为广大科研工作者和学生提供借鉴和参考。
一、实验目的生物技术制药综合实验的目的是让学生全面了解和掌握生物技术在制药领域的应用。
通过实验，学生可以了解生物技术制药的原理、实验操作和数据分析方法，培养学生的创新意识和实践能力。
二、实验内容1.基因工程细菌的构建基因工程细菌是制药领域中常用的工具，通过基因工程技术，可以将外源基因导入细菌中，使细菌表达目标蛋白。
实验中，可以选择一种适合表达目标蛋白的细菌菌株，如大肠杆菌等，构建表达载体，将目标基因插入到表达载体中，然后转化到细菌中，进行培养和诱导表达。
2.原核表达蛋白的纯化和鉴定在实验中，可以通过蛋白纯化技术，从转化的细菌中纯化目标蛋白，然后通过SDS-PAGE、Western blot等方法对蛋白进行鉴定。
这一步骤可以让学生了解蛋白纯化的原理和技术，培养学生的动手能力和实验操作技能。
3.细胞培养和药物筛选在制药领域，细胞培养是不可或缺的环节。
在实验中，可以选择适合用于药物筛选的细胞系，如HEK293细胞、Hela细胞等，将药物加入培养基中，观察细胞的生长情况和药物的毒性和活性。
4.药物分子构效关系研究药物分子构效关系研究是生物技术制药的重要内容之一，通过分子生物学和生物化学手段，研究药物分子与靶标的作用机制和关系。
实验中可以选择一种常用药物，通过分子对接、酶活性检测等方法，研究药物分子与靶标的结合特点和作用机制，揭示药物的作用方式和规律。
三、实验方法1.实验前准备在进行生物技术制药综合实验之前，需要充分准备实验材料和仪器设备，包括培养基、细菌菌株、表达载体、药物样品等。
需要对实验步骤和方法进行充分了解和掌握，确保实验的顺利进行。
《生物技术综合实验》教学体系改革及效果评价
广 州 化 工
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ＣｈｅｍｉｅＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
Ｖｏ１．４１ Ｎｏ．２１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ．２０１３
《生物 技 术 综 合 实验》 教 学体 系 改革及 效 果评 价 水
阎晓菲 ，童 婷 ，代培红 ，杨 斌 ，陈 琴 ，谢文华 ，张新玲
ＹＡＮ Ｘｉａｏ—ｆｅｉ ，ＴＯＮＧ Ｔｉｎｇ ，ＤＡＩ Ｐｅｉ—ｈｏｎｇ。，ｒＡＮＧ Ｂｉｎ ，ＣＨＥＮ Ｑｉｎ ，Ｘｉｅ Ｗｅｎ—ｈｕａ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ—ｌｉｎｇ （１ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｒｕｍｑｉ ８３００００； ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒ ｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｒｕｍｑｉ ８３００５２，Ｃｈｉｎａ）
学 院培养 学生的 目标。
关键 词 ：生物技术综合实验；教学内容；教学方法；改革；教学效果
中 图分类 号 ：Ｇ６４２．４２３
文献 标识 码 ：Ａ
文章编 号 ：１００１—９６７７（２０１３）２１—０１４７－０３
Ｒｅｆｏｒｍ ｏｎ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｕｂｊｅｃｔ，ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓｋｉｌｌｓ ｗｅｒｅ
生物技术综合性实验教学的探索和实践
近年来 ， 随着现 代生 物技 术 的迅 猛发 展 ， 用功 运 能基 因组 学 、 白质 组学 、 蛋 生物 信息 学等 现代生 化 与
分子 生物 学技术 ， 合 基 因工 程 、 白质工 程 、 结 蛋 细胞
课 ， 一段 理论 课 ， 排 一 次实 验 课 ， 学 内容 多 为 上 安 教
施、 效果等方面探讨 了生物技 术专业综合性 实验 的教 学， 以期为生物技术 实验教 学改革提供借鉴 。 关键词 ： 生物技术 ； 教学改革 ； 综合性实验
中 图分 类 号 ： Ｒ １ Ｇ ４ ． ３ ８ ６ ２０ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １０ ７ ４ （０ ８ ０ ０ ８ ０ ０ ８— ２９ ２ ０ ）５— ５ ２— ３
重要性 ， 为此 ， 我们开设基 因工程 制药综合性实验 ，
尝试 把 生物 信息 学 、 因工程 、 酵工 艺 、 白质 药 基 发 蛋 物 分离 纯化 等课程 某些 章节 中分 散 的实验课 内容汇
编 成综 合性 大实 验用 于教 学 ， 以期 帮 助 学 生理 清 生 物 技术 的专 业脉 络 ， 进知识 的融会 贯通 ， 促 获得 更好
项 目以验 证性 实验 为 主 ， 验 的教 学 内容 和 教 学 方 实 法陈旧， 已不 能适 应 生 物 技术 迅 猛 发 展 的需 要 。随 着 全 国高校 实验教 学 改革 的开展 ， 实验 向着 综合 性 、 创 新性 等方 向发 展 。近 年 来 ， 们 对 生物 技 术 专 业 我
Ｅｘ ｌ ｒ ｔｏ ｎ ｒ ｃ ｃ ｎ ｃ ｍｐｒ ｈ ｎ ｉ ｅ ｅ ｅ ｉ ｎ ａ ｅ ｃ ｉ ｇ ｏ ｉ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｐｏ ａ ｎ ａ ｄ ｐ ａ ｔ ｅｏ ｏ ｉ ｉ ｅ ｅ ｓｖ ｘ ｒｍｅ ｔ ｌｔａ ｈ ｎ ｆｂ ｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｐ
生物技术大实验完整版
生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。
蛋白质工程也成为“第二代基因工程”生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列二级结构：双螺旋结构三级结构：超螺旋结构DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象减色效应：DNA复性时，OD260值下降影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
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2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化1.文献综述绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。
来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。
GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。
严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。
北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。
下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。
他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。
Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。
在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。
钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。
同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。
这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
2.实验器材2.1实验材料：含GFP融合质粒，Top10菌株2.2实验试剂：质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mM EDTA /25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2M NaOH/1% SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TE Buffer；转化：0.1M预冷CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；GFP提取：液氮，Lysis Buffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）)Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0) SDS-PAGE电泳：PEG10000，Loading Buffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等2.3实验仪器高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。
3.实验方法3.1质粒提取1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5ml EP管中；6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm 离心8min，弃上清；7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；9.加40μL TE Buffer溶解DNA，4℃备用。
3.2感受态细胞的制备以及转化1.取1.5mL Top10菌液，在4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；2.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃ 4000rpm离心10min，弃上清；3.加200μL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；5.42℃热激90s；6.立即放在冰上3-5min；7.加入800μL LB液体培养基，37℃ 150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；8.取200μL菌液涂布在LB（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。
3.3扩大培养1.取含GFP 质粒的Top 10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL 的LB 液体培养基，100ng/ml 的Amp 和4mg/ml 的阿拉伯糖）37℃，200rpm 振荡培养至对数生长期（约3-4h ）；3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mL LB 液中（Amp 工作浓度 100ng/ml ，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml ），37℃，200rpm 培养过夜。
3.4细胞破碎1.将培养好的细菌3000g 离心10min ，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；2.用30mL Lysis Buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA )悬浮沉淀；3.向悬浮液中加15mg 溶菌酶，混匀后室温溶解10min ；4.400W 功率下，超声处理10min ；5.将破碎液9000g 离心15min ，紫外灯观察，留上清备用；6.选取合适的浓度破碎(NH 4)2SO 4沉淀GFP ；一般(NH 4)2SO 4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP 沉淀量达最大附：(NH 4)2SO 4浓度与含量表，体积为10ml ；7.向上清中加5.28g (NH 4)2SO 4，充分溶解，室温放置20min ，9000rpm(NH 4)2SO 4饱和度10% 20%30%40%50%60%70%80%90%(NH 4)2SO 4（g ） 0.561.14 1.762.433.13 3.94.725.616.62离心15min，转移上清至另一试管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用；3.5疏水作用层析1.将沉淀的GFP，用10mL 2M(NH4)2SO4/Lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）2.用3倍体积平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.将步骤1中的上清液上柱，用3倍柱体积的Washing Buffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；5.将收集液透析过夜。
（3号样品）3.6离子交换层析1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min，弃去沉淀（4）；2.用3倍体积的Start Buffer(A液)平衡柱子；3.将步骤1中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的Start Buffer洗柱子；4.梯度洗脱GFP，梯度液：Start Buffer(A液)、Elution Buffer(B液)，紫外灯观察，GFP快流出来时，准备收集5.将收集液透析过夜(透析液为A液)。
3.7凝胶过滤纯化GFP1.将透析袋置入含PEG10000的培养皿中，浓缩至体积约2mL；2.用3倍柱体积的20mM Tris-HCl，pH7.0平衡柱子；3.将步骤1中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外灯检测，GFP快流出时收集备用。
3.8 SDS—PAGE将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。
1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。
2.分离胶的制备按下列成分配制分离胶：各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为浓缩胶留出足够空间。
轻轻在顶层加入一薄层20%乙醇封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。
凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的乙醇，用滤纸吸干凝胶顶端的乙醇。
3.浓缩胶的制备按下列成分配制2mL 5%的积层胶：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.0M Tris(pH6.8) 10%SDS10%过硫酸铵TEMED 7.35mL 1.3mL 1.25mL 0.1mL 0.1mL 0.1mLddH2O30%丙烯酰胺混合液1.5M Tris(pH8.8) 10%SDS10%过硫酸铵TEMED 8.2 mL 6.68mL 5.0mL 0.1 mL 0.1 mL 0.04 mL各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。
4.待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。
5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。
6.样品在浓缩胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。
7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇，0.05%考马斯亮蓝，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色45min，之后取出凝胶并回收染色液，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色1h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察结果并拍照。
（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行SDS-PAGE。
）思考题1.实验纯化效果如何？如果要得到较纯的GFP，你会采用哪些方法进一步纯化？答：实验纯化效果请见实验结果分析。
2.SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分？它们有什么作用？为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸？答：SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白质变形，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。
3.常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？答：交联葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。