生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology
生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology
鉴 定 所 提 取 总 RNA 分 子 的 质 量 ， 可 以 通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得 28S、18S条带来判断。
Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma
其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的 激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活 性。
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
二、真核细胞染色体DNA的制备
掌握真核生物基因组DNA的提取的 基本原理。
提取高质量基因组DNA的主要析
真核细胞染色体DNA的制备过程
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
rRNA在总RNA分子中含量最丰富 ，由28S、 18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大， 分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分 子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子 交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在 细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白 及 有 些 组 蛋 白 mRNA 以 外 ) ， 均 在 3’ 端 存 在 20250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可 很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分 离mRNA。
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
教学要求
通过教学，要求学生掌握分子生物学与基因工程的 基本理论，巩固所学的理论知识；
生物工程综合性实验名词解释
1.fermentation(发酵)：利用生物细胞（含动植物、微生物)，在合适条件下经特定的代谢途径转变成所需产物菌体的过程。
2.fermentation engineering(发酵工程)：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞(包括动植物、微生物)参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。
3.bioengineering(生物工程)：以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程，机械工程，控制工程，环境工程等工程科学，研究或发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程科学。
广义上说是指运用生物科学知识及工程学的原理，开发利用生物材料为人类社会提供产品和服务的工程技术。
狭义上是指以基因工程技术为核心的现代生物技术的总称4.biocatalyst(生物催化剂)：指传统发酵所利用的微生物外，还包括现在生物技术所利用的动植物细胞或细胞中的酶5.isolation of strain(菌种分离)：根据生产要求和菌种特征性采用各种不同的筛选方法从众多的杂菌种分离出所需的性能良好的纯种6.Strain breeding (菌种选育)：从分离筛选获得的有价值菌种中经过人工选育出各种突变体以大幅提高了菌种产生有价值的代谢产物的水平，改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新代谢产物7.Nature breeding(自然选育)：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程8.Mutation breeding (诱变育种)：利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学因素试剂处理微生物细胞提高基因突变率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质植株9.Cross breeding(杂交育种)：通过杂交方法，将不同植株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷10.Culture preservation/maintenance of culture(菌种保取)：根据菌种的生理生化特点，人为创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异11.Growth factor(生长因子)：具有刺激细胞生长活性的因子。
学科综合实验报告
实验名称：现代生物技术综合实验实验目的：1. 理解并掌握现代生物技术的基本原理和方法。
2. 学习和运用PCR技术、DNA测序和基因克隆等现代生物技术。
3. 培养团队协作能力和科学实验操作技能。
实验时间：2023年3月15日实验地点：生物技术实验室实验器材：1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、DNA测序仪、离心机、恒温培养箱等。
2. 实验试剂：DNA模板、引物、PCR试剂、DNA测序试剂、质粒提取试剂盒等。
3. 实验材料：大肠杆菌、酵母菌、植物组织等。
实验步骤：一、PCR扩增1. 设计引物：根据目的基因序列，设计一对特异性引物。
2. PCR反应：将DNA模板、引物、PCR试剂混合，进行PCR反应。
3. PCR产物检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
二、DNA测序1. DNA提取：从实验材料中提取DNA。
2. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。
3. DNA测序：将纯化的DNA进行测序，得到目的基因序列。
三、基因克隆1. 质粒提取：从大肠杆菌中提取质粒。
2. 质粒纯化：使用质粒纯化试剂盒进行质粒纯化。
3. 酶切连接：将目的基因和载体进行酶切连接。
4. 转化：将连接产物转化到大肠杆菌中。
5. 阳性克隆筛选：通过PCR或DNA测序筛选出含有目的基因的阳性克隆。
实验结果与分析：一、PCR扩增结果通过PCR扩增，成功得到目的基因片段，大小与预期相符。
二、DNA测序结果通过DNA测序，得到目的基因的核苷酸序列，与预期序列一致。
三、基因克隆结果通过阳性克隆筛选，成功克隆出目的基因，并将其表达在酵母菌中。
实验讨论：1. PCR技术在基因克隆和基因分析中具有广泛的应用，其灵敏度、特异性和快速性使其成为现代生物技术中的重要工具。
2. DNA测序技术可以精确地测定目的基因的核苷酸序列，为基因功能研究和基因工程提供重要信息。
3. 基因克隆技术是实现基因表达和蛋白质纯化的关键步骤，为生物制药、基因治疗等领域提供了有力支持。
生物学教育综合试验
生物学教育综合实验Comprehensive Experiment of Biological Education【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课【学分数】4学分【适用专业】生物科学【学时数】 128学时【编写日期】 2009年6月一、教学目标本课程是在生物化学、发育生物学及现代生物技术等理论课的基础上，开设的一门基础性兼综合与设计性实验课。
该课程的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的生化、发育生物学及现代生物技术等领域的研究技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验，一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生学会现代生物技术常规的仪器设备及部分大型仪器设备的使用，并进一步培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力，提高学生从事科学研究的综合素质。
二、教学内容和学时分配实验一、实验总论4学时基础性主要内容：课程设计思路简介，实验准备（清理仪器、配置试剂等）。
教学要求：了解生物学教育综合实验课的目的与要求、评分标准及仪器操作要求。
重点、难点：理论学习与试剂的配置。
实验二、碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定28学时综合性主要内容：大肠杆菌单菌落碱性磷酸酶的诱导表达，菌体收集和超声破碎，分离纯化碱性磷酸酶（离子交换层析法、硫酸铵沉淀法和分子筛层析法），样品的浓缩与保存、分离纯化参数的测定、分离纯化过程的提纯倍数与回收率的确定以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
教学要求：了解蛋白质分离纯化的基本过程；理解蛋白质分离纯化重要技术（原核表达、离心、细胞破碎、沉淀法、离子交换层析、透析）的原理与应用范畴以及蛋白质浓度和酶活力的原理；掌握蛋白质分离纯化基本技术（原核表达、离心、细胞破碎、沉淀法、离子交换层析、透析）的操作方法，蛋白质浓度及酶活力测定法的操作方法，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法，离心机、超声破碎仪、恒流泵、核酸/蛋白检测仪、记录仪、部分收集器以及分光光度计的使用方法。
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。
γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。
GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。
实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1. 了解真核生物RNA提取的原理；2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
二、实验原理Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。
TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。
三、实验材料1. 材料甘薯叶片，品种为徐薯182. 试剂①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；② Trizol试剂；③氯仿；④异丙醇、75％乙醇；⑤ TBE缓冲液；⑥上样缓冲液3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP 管架四、实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；6. 室温放置10 min晾干沉淀；7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。
《生物技术综合实验》教学大纲
《生物技术综合实验》实验课程教学大纲课程名称(中文) 生物技术综合实验课程名称(英文) Comprehensive Experiments of Biotechnology课程编号33101105课程类型专业必修课教材名称《生物技术综合实验指南》（陆勇军等）自编教材是否独立设课是√否学时学分:总学时 108 总学分 3 实验学时108实验学分3开出时间：四年级第十学期适用专业生物技术专业、生物技术及应用专业、逸仙班先修课程《生物化学》、《生物技术学》、《微生物学》、《遗传学》备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课一、课程简介及基本要求本课程是一门综合性实验课程。
要求学生在掌握生物化学、生物技术学、微生物学和生物化学技术原理等的基础上，学习和掌握生物技术实验的基本原理和技术，主要包括基因工程常规操作（如从生物材料中提取功能基因、再把该基因克隆到载体DNA上。
然后转化至细菌或酵母中进行表达等）技术及一系列生物大分子的提取（包括从微生物、动物或植物材料中提取）、分离、纯化的方法和技术。
了解并掌握各种常规生化仪器及发酵器材的使用和保养；培养和训练学生具有良好的科研素质、有较强的分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。
二、课程目的及要求1.通过实验综合运用各门理论课相关知识，并加深理解。
2.培养学生实事求是的科学品德、团结合作的科学工作精神、善于思考和分析、解决问题的能力，全面提升他们的科研素质，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。
3.要求学生课前做好预习，熟悉每个单元实验的原理和方法，也可根据自己的理解和兴趣，设计相关研究实验。
4.实验过程中，要求学生掌握各种常规生化仪器及发酵器材的规范操作。
实验室实行开放式管理，以小组形式独立自主完成实验。
三、适用专业生物技术专业、生物技术及应用、逸仙班四、主要仪器设备紫外及可见分光光度计、电泳仪及电泳槽、（高）低速离心机、电子天平、电热恒温水浴箱、干燥箱、冰箱、高压灭菌锅、恒温摇床、PCR仪、超净工作台、酶标仪、蛋白纯化系统、凝胶图像分析系统、各种规格的微量进样器等。
生物技术大实验
生物技术大实验北京师范大学生命科学学院井健生物技术实验课的确立一、生物技术实验课的重要性二、我校生物技术实验课的特色三、我校生物技术实验课如何与其他实验课程衔接四、我校生物实验课的安排内容生物技术Biotechnology利用生物(动物、植物或微生物)或其产物来生产对人类医学或农业有用的物质或生物。
传统生物技术：酿造发酵配育新种现代生物技术：以生物化学或分子生物学的操作方法，来改变生物或其分子的(遗传) 形质，以达上述目的。
以新的技术来解决已有的问题课程特色综合性：多种研究对象、多个技术方案、多类实验方法、多层次研究内容实用性：面向科研实际、面向生产实践系统性：完整研究方案的雏形先进性：力求把先进的生物技术、方法引入到教学领域，反映科学研究前沿生物技术实验课的确立领导的支持：•北京师范大学生命科学学院生物化学及生物技术系主任魏群教授；•北京师范大学生命科学学院副院长桑建利教授；•北京师范大学生命科学学院院长葛剑平教授；•北京师范大学教务处副处长方瑾教授；生物技术实验课的开展•指导教授：魏群教授•植物基因工程部分：肖尊安；•细胞工程、发酵工程、酶工程等部分：马晴、井健；•中心实验室：鲍蕾、戴中心。
课程开设对象生命科学学院：•生物技术专业大学四年级上学期本科生；•一年级硕士研究生；•外校进修教师；前期参加的实验课程•微生物学实验，大学二年级下学期；•分子生物学大实验（北京市精品课程，现申报国家精品课程），大学三年级上学期；•生物化学大实验，大学三年级下学期；•细胞生物学实验，大学三年级下学期；理论课程前期学习的主要理论课程：生物化学；分子生物学；基因工程；蛋白质工程；微生物学；细胞生物学；同时开设的课程：分子酶学；发酵工程；课程开设目的一、加强实验课程的综合性训练，进一步提高学生的工作能力；二、开拓学生眼界，了解现代生物技术知识；三、为学生将来从事具体的科研与实际工作打基础。
实验课程内容安排一、植物基因工程二、细胞工程三、发酵工程四、酶工程五、免疫技术六、双向电泳技术一、植物基因工程1、烟草叶片愈伤组织的诱导与器官发生2、农杆菌转染与共培养3、原生质体的分离与培养4、体细胞融合和杂交5、转基因烟草的筛选与鉴定二、细胞工程1、利用昆虫细胞进行溶栓蛋白的瞬时表达2、利用Hela细胞结合荧光显微技术观察gfp基因及gus基因的表达三、发酵工程1、固体发酵法制备柠檬酸的实验2、液体发酵法制备链霉素的实验3、基因工程制药技术四、酶工程1、利用Al2O3固定化酶技术制备 -半乳糖苷酶的固定化载体并测定酶学性质变化2、利用其他技术制备固定化酶五、免疫技术1、单克隆抗体技术2、免疫扩散-电泳检测技术3、酶联免疫吸附技术六、双向电泳技术1、双向电泳技术2、双向电泳技术的应用总结与讨论1、对现代生物技术的认识2、现代生物技术在科研与生产实践中的应用3、设计实验课程参考文献•生物工程技术实验指导，魏群主编，北京：高等教育出版社，2002年。
现代生物技术综合实验PPT课件
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15) 每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝
胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
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在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大， RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此， 可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样 品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
DNA的完整性； 14. 利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。 15. （方法同实验二）
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六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
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实验四 PCR反应
一、实验目的
了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
10 × PCR buffer
5μl
dNTP mixture 前向引物 (P1) 反向引物 (P2) DNA 模板
rTaq酶 灭菌蒸馏水
4μl 8μl 8μl 0.5μl 0.5μl 24μl
所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，
为了防止反应混合液蒸发，可添加30μl矿物油覆盖。
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Comprehensive experiments of biotechnology
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主要内容 Contents：
一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of
Nucleic Acid
二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern
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金属螯合亲和层析
a. 许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可 能会吸附该金属。 b. 若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会 专一性地吸附需要此金属的蛋白质。 c. 基因操作时，经常在表达蛋白质的末端加上一 段含有六个 His 的片段；则此表达蛋白质，可以 吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出 来。 d. 这种载体上结合有某些可与金属产生配位键 的基团 (如 nitrilotriacetic acid)，这些基团与金 属离子结合 (如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。
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凝胶过滤层析柱
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胶球大小-介质离子粗细影响流动
(1) 胶球颗粒有一定大小，一般可分为 corse, medium, fine, super fine 四种粗细 (grade)；越粗的胶体，流率越好，但分 辨率越差。 因胶球外面的缓冲液是由胶球表面向内扩散， 样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散 出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。 (2) 下图说明这种扩散介质的机制。 而近年来因材料科学的 进步，发展出通透性特强的胶球，缓冲液可直接浸润而进 入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion弥散式的胶体， 效果较好且快速。商品化称为 perfusion c辑ppt
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对 酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等） 以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M （如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L， 或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束 缚特异物质的能力。
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特异性配体亲和层析法与通用性配 体亲和层析法
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两大类离子交换介质
由介质带电基团的不同，可分为两大类： 介质－带电基团(counter ion) (1) 阳离子交换介质 (cation exchanger)： 载体-阴离子基团 ..... 阳离子 (2) 阴离子交换介质 (anion exchanger)： 载体-阳离子基团 ..... 阴离子
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阳离子： 两价阳离子 > NH4+ > K+ > Na+ > H+ > Li+ 阴离子： I - > Br - > Cl - > HCO3- > CH3COO-, OH-
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四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激 素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类 似，每对反应物之间都有一定的亲和力。在亲 和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分 子之间具有亲和力，并产生复合物。
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胶球大小-介质离子粗细影响流动
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二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相， 液体为流动相的系统中进行的。离子交换 剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方式进行，或借助 离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离 子化合物的吸附作用进行。
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疏水性层析法
(1) 蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极 性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定相载 体上；若环境的极性降低，则可被洗脱出来，即为 疏水性层析法 (hydrophobic interaction chromatography, HIC)。
(2) HIC 没有亲和层析析法那么强的专一性，较似 离子交换法，但所根据的作用力，则是非极性基团 间的疏水性引力。
and ion of cDNA Library
and DNA Library
七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and
Expression
八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein
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反相层析法
(1) 是 HIC 及离子交换法的综合体，但属于一种 partition 层析；可使用离子交换 (或类似 HIC) 的介质。 (2) 混合极性及非极性溶液为流动相，当流动相 通入介质后，介质表面可固定其中的极性溶液 (若使用 HIC 介质则固定非极性者)，样本分子会 在此二相中进行 partition 分离。 (3) 因固定相及流动相的极性刚好相反，故名 reverse phase。
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1 表达蛋白质的分离沉淀
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3
蛋白质分离
培养基
收集菌体 洗涤
上清液
破碎细胞
超声破碎 化学法 溶菌酶
分级沉淀
等电沉淀 盐析沉淀 高分子物 质
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1.1 凝胶过滤层析
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝 胶小球具有网状结构，小分子物质能进 入其内部，而大分子物质却被排除在外 部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱 时，溶液中的物质就按不同分子量筛分 开了。
特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生 命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物 等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。
通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的 小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等）， 它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善 吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
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