第3章高效液相色谱分析
经典液相色谱法
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
仪器分析考试题及答案
仪器分析考试题及答案第一部分：仪器分析练题及答案第2章气相色谱分析一．选择题1.在气相色谱分析中,用于定性分析的参数是()A保留值B峰面积C分离度D半峰宽2.在气相色谱分析中,用于定量分析的参数是()A保留时间B保留体积C半峰宽D峰面积3.使用热导池检测器时,应选用下列哪种气体作载气,其效果最好？()A H2B HeC ArD N24.热导池检测器是一种()A浓度型检测器B质量型检测器C只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器D只对含硫、磷化合物有响应的检测器5.使用氢火焰离子化检测器,选用下列哪种气体作载气最合适？()A H2B HeC ArD N26、色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中（）的差别。
A.沸点差，B.温度差，C.吸光度，D.分配系数。
7、选择固定液时，一般根据（）原则。
A.沸点高低，B.熔点高低，C.相似相溶，D.化学稳定性。
8、相对保留值是指某组分2与某组分1的（）。
A.调整保留值之比，B.死时间之比，C.保留时间之比，D.保留体积之比。
9、气相色谱定量阐发时（）请求进样量特别正确。
A.内标法；B.外标法；C.面积归一法。
10、理论塔板数反映了（）。
A.分离度；B.分配系数；C．保留值；D．柱的效能。
11、下列气相色谱仪的检测器中，属于质量型检测器的是（）A．热导池和氢焰离子化检测器；B．火焰光度和氢焰离子化检测器；C．热导池和电子捕获检测器；D．火焰光度和电子捕获检测器。
12、在气-液色谱中，为了改动色谱柱的选择性，主要可进行以下哪种（些）操纵？（）A.改动固定相的品种B.改动载气的品种和流速C.改变色谱柱的柱温D.（A）、（B）和（C）13、进行色谱分析时，进样时间过长会导致半峰宽（）。
A.没有变化，B.变宽，C.变窄，D.不成线性14、在气液色谱中，色谱柱的使用上限温度取决于（）A.样品中沸点最高组分的沸点，B.样品中各组分沸点的平均值。
C.固定液的沸点。
D.固定液的最高利用温度15、分配系数与下列哪些因素有关（）A.与温度有关；B.与柱压有关；C.与气、液相体积有关；D.与组分、固定液的热力学性质有关。
(第三章)药物分析-色谱分析法
纸色谱
1）紫外光 ：对未知化合物，展开后在用显色剂以前，应先在紫 外灯下进行察看。紫外光常用两种波长254 nm与365 nm。
2）碘：碘是一种非破坏性显色剂，价廉易得，显色迅速、灵敏。 与物质的反应往往是可逆的。
3）水：为非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，纸色谱不常用。
纸色谱
④ 测量Rf值与鉴定：
必须注意：展开剂也须事先用缓冲液平衡后再使用。
斑点拖尾现象形成的几种原因：
① 点样量过多，超过了滤纸溶剂的溶解能力。
② 物质电离，导致Rf值差异。
③ 被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形 成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 ④ 某些物质在展开过程中分解，产物有不同的Rf值。
样点朝上，展开剂从上向下通过薄层或滤纸。展开 剂通过滤纸条或纱布条作为桥梁进行转移。展开剂 受吸附和重力的双重作用，展开较快。
特 殊 装 置
纸色谱的下行展开法
3. 双向展开
用于某些复杂成分或Rf值较小的成分的展开
B
d
C
c
b
a
d
c
b
a
A
混合样品
CB
A
**边缘效应： 消除边缘效应的方法： 1. 将展开槽、纸或薄层板用展开剂蒸气饱和； 2. 在层析缸内壁贴上用展开剂浸湿的滤纸条； 3. 点样位置距离边缘一定距离。
（1）氧化铝：有碱性、中性和酸性三类，粒度规格大多为100～150目。 碱性氧化铝（pH9~10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的 样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。 酸性氧化铝（pH3.5~4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素 和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7~7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性 介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也用来分离弱的有机酸和碱等。
第3章高效液相色谱分析
第3章高效液相色谱法一、判断题1、高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（）2、高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
( )3、高效液相色谱中通用型检测器是荧光检测器。
( )4、液相色谱中常采用改变流动相的种类和配比的方法来提高柱的选择性。
( )5、在液相色谱中，速率方程中的涡流扩散项可以忽略不计。
( )二、选择题1、液相色谱的H-u曲线( )A、与气相色谱的H-u曲线一样，存在着H minB、H随流动相的流速增加而逐渐增加C、H随流动相的流速增加而下降D、H受u影响很小2、提高液相色谱分离效率的主要途径或措施是( )A、增加柱长，保持低温B、采用相对分子量较大的流动相，减少分子扩散C、采用相对低流速，有利于两相间的质传递D、采用细粒度键合固定相3、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较，前者没有A、贮液器B、高压泵C、程序升温D、梯度淋洗装置4、在液相色谱中，最普遍使用的检测器是A、紫外光度检测器:B、荧光检测器C、差示折光检测器D、电导检测器5、有下列四种液相色谱类型，样品峰全部在溶剂峰之前流出的是( )A、液-液色谱法B、液-固色谱法C、离子排斥色谱法D、空间排阻色谱法6、液相色谱中，影响色谱峰展宽的主要因素是( )A、纵向扩散B、涡流扩散C、传质阻力D、柱前展宽7、对于能迅速溶于水的试样，宜选用的液相色谱是A、正相液液色谱B、反相液液色谱C、液固吸附色谱D、空间排阻色谱8、对溶于水或非水溶剂，分子大小有差别的试样，宜选用的液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱9、对于能溶于酸性或碱性水溶液的试样，宜选用的液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱10、在气相色谱法中可以忽略，而在高效液相色谱中则必须加以考虑的速率方程中的项是A、流动相传质项B、涡流扩散相C、固定相传质项D、分子扩散相。
1从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液 相
减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温 其中,减小粒度是最有效的途径.
4. 液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么? 在这些类型 的应用中,最适宜分离的物质是什么?
解:液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等.
毛细管凝胶电泳(CGE) 是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质， 如交联或非交联的聚丙烯酰胺。荷质比相等，但分子的大小不 同的分子，在电场力的推动下在凝胶聚合物构成的网状介质中 电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状 结构时受到的阻力不同，大分子受到的阻力大，在毛细管中迁 移的速度慢；小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度 快，从而使它们得以分离。这就是CGE的分离原理．
解:在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动 相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析 柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制 型离子色谱法.
例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相，钠离子的干 扰非常严重，这时可在分析柱后加一根抑制柱，其中装填高容 量H+型阳离子交换树脂，通过离子交换，使NaOH转化为电导 值很小的H2O，从而消除了背景电导的影响．
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸 点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试 样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、 相对分子量大的限制。
2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比 较, 有哪些主要不同之处?
09第三章液相色谱
出峰顺序相反。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极 性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
非极性~中等极性组分（用于HPLC 80%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
离子交换色谱 ion-exchange chromatography
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液 ；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组
4.7.2
离子色谱流程与装置类型
抑制型；非抑制型:
排阻色谱
size- exclusion chromatography
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可 对 相 对 分 子 质 量 在 100-105 范围内的化合物按质量分离
兼顾柱效和分析时间， 选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响因素
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
第三章
高效液相色谱
(High Performance Liquid Chromatography )(HPLC)
液相色谱仪
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第3章高效液相色谱法
一、判断题（对的打√, 错的打×）
1、高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）
2、液相色谱指的是流动相是液体，固定相也是液体的色谱。
( ×)
3、高效液相色谱中通用型检测器是荧光检测器。
( ×)
4、液相色谱中常采用改变流动相的种类和配比的方法来提高柱的选择性。
( √)
5、在液相色谱中，速率方程中的涡流扩散项可以忽略不计。
(×)
二、选择题
1、液相色谱适宜的分析对象是（B）
A、低沸点小分子有机化合物
B、高沸点大分子有机化合物
C、所有有机化合物
D、所有化合物
2、高效液相色谱实现高效、快速分离与分析的重要原因是（ D ）
A、采用了高压输液泵和微粒固定相
B、采用了梯度淋洗和恒温系统
C、采用了微粒固定相和和恒温系统
D、采用了高压输液泵和梯度淋洗
3、高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，采用高压主要是由于（C）
A、可加快流速，缩短分析时间
B、高压可使分离效率显著提高
C、采用了细粒度固定相所致
D、采用了填充毛细管柱
4、液相色谱的H-u曲线( B)
A、与气相色谱的H-u曲线一样，存在着H min
B、H随流动相的流速增加而逐渐增加
C、H随流动相的流速增加而下降
D、H受u影响很小
5、在液相色谱分离过程中，范氏方程的哪一项对柱效能的影响可以忽略不计（C）
A、涡流扩散项
B、流动相中的传质阻力
C、分子扩散项
D、固定相传质阻力项
6、在液相色谱中，在以下条件中，提高柱效最有效的途径是（A）
A、减小填料粒度
B、适当升高柱温
C、降低流动相的流速
D、增加柱长
7、提高液相色谱分离效率的主要途径或措施是( D )
A、增加柱长，保持低温
B、采用相对分子量较大的流动相，减少分子扩散
C、采用相对低流速，有利于两相间的质传递
D、采用细粒度键合固定相
8、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较，前者没有（ C ）
A、贮液器
B、高压泵
C、程序升温
D、梯度淋洗装置
9、高效液相色谱中的下列检测器中，属于通用型检测器的是（ A ）
A、紫外光度检测器
B、荧光检测器
C、差示折光检测器
D、电导检测器
10、对于反相色谱，流动相的极性与固定相的极性之间关系是（A）
A、流动相极性大
B、流动相极性小
C、两者相同
D、以上都不是
11、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（ D ）
A、恒温箱
B、进样装置
C、程序升温
D、梯度淋洗装置
12、对各种氨基酸的分析，最有效和方法是（ B ）
A、气相色谱
B、高效液相色谱
C、气固色谱
D、紫外吸收光谱
13、如果样品的相对分子量在200~2000之间，一般可考虑的色谱分离方法是（C）
A、气相色谱法
B、空间排阻色谱法
C、液相色谱法
D、以上都不是
14、在高效液相色谱分析中，提高色谱柱柱效率的最有效途径是（A）
A、减小载体颗粒
B、适当升高柱温
C、降低流动相的速度
D、降低流动相的粘度
15、对于正相色谱，流动相的极性与固定相的极性之间关系是（B）
A、流动相极性大
B、流动相极性小
C、两者相同
D、以上都不是
16、如果试样中各组分无法全部出峰或只要测定试样中某几个组分，那么应采用下列哪种方法为宜？（C）
A、归一化法
B、外标法
C、内标法
D、标准工作曲线法
三、简答题
1、列表比较气相色谱和高效液相色谱的特点。
第三章高效液相色谱分析参考答案
一、判断题
1、√
2、×
3、×
4、√
5、×
二、选择题
1、B
2、D
3、C
4、B
5、C
6、A
7、D
8、C
9、A 10、A 11、D12、B13、C14、A15、B16、C
三、简答题
略。