体外抗体形成细胞
溶血空斑试验
溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。
溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。
溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。
溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。
3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。
将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。
4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。
5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术是一种通过体外合成获得具有单一抗体特异性的抗体的方法。
它的基本原理是将目标抗原注射到动物体内，使其免疫系统产生多种抗体。
然后，从动物的脾脏或骨髓中提取免疫细胞，并与癌细胞融合形成杂交瘤。
杂交瘤是一种具有细胞融合能力的免疫细胞，在体外环境中能够不断增殖，并持续产生抗体。
这些杂交瘤细胞称为“克隆”，每个克隆对应一种特定的抗体。
在获得这些抗体的克隆细胞后，科学家使用细胞培养和筛选技术，筛选出能够高效产生目标抗体的克隆细胞。
通过单克隆抗体技术，可以得到高纯度、高特异性的抗体。
这些抗体可以用于检测特定抗原的表达、分析细胞信号传导、研究蛋白质功能等领域。
与传统的多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的重现性和稳定性，因此在医学诊断和生物学研究中有广泛应用。
抗体产生的过程
抗体产生的过程抗体是机体免疫系统中一类重要的蛋白质分子，它们能够识别并结合外来的抗原，从而帮助机体抵御病原体的入侵。
抗体的产生是一个复杂而精确的过程，涉及到多种免疫细胞的相互作用与调控。
本文将从免疫细胞的活化、抗原的识别、抗体的合成等方面，详细介绍抗体产生的过程。
免疫细胞的活化是抗体产生的第一步。
当机体遭遇外来抗原时，免疫系统中的抗原递呈细胞（如树突状细胞）会摄取并陈列抗原碎片，将其展示在细胞表面的MHC分子上。
这些抗原递呈细胞会迁移至淋巴器官，与免疫系统中的淋巴细胞相互作用。
若抗原递呈细胞激活了T细胞，就会启动免疫反应的第一道防线。
激活的T细胞会分化为不同的亚群，其中一部分T细胞成为辅助T细胞（Th细胞），它们与B细胞发生相互作用，促进抗体的产生。
抗原的识别是抗体产生的关键步骤之一。
在免疫细胞的活化过程中，B细胞也会与抗原发生结合。
B细胞表面的抗原受体（BCR）通过与抗原结合，使B细胞得以识别与特定抗原相对应的免疫刺激。
一旦B细胞与抗原发生结合，就会激活B细胞并启动抗体产生的过程。
抗体的合成是抗体产生的核心环节。
激活的B细胞会分化为浆细胞，这些浆细胞具有合成和分泌抗体的能力。
在浆细胞的内质网中，抗体的基因已经被转录和翻译，形成了完整的抗体分子。
这些抗体分子会被包裹在细胞质内的囊泡中，然后通过分泌途径释放到细胞外。
一旦抗体进入体液中，它们就会与抗原结合，并参与到机体的免疫反应中。
抗体通过结合抗原，可以中和病原体、促进病原体被巨噬细胞吞噬、激活补体系统等，从而协助机体清除病原体。
除了浆细胞外，激活的B细胞还可以分化为记忆B细胞。
记忆B细胞具有长时间存活的能力，并且能够迅速应对再次遭遇相同抗原的情况。
当机体再次遭遇相同抗原时，记忆B细胞会迅速分化为浆细胞，合成大量抗体，从而迅速启动抗原特异性免疫反应。
这就是机体具有免疫记忆的原因，也是疫苗接种等免疫策略的基础。
总结起来，抗体产生的过程可以分为免疫细胞的活化、抗原的识别和抗体的合成三个关键步骤。
体外抗体形成细胞检测—定量溶血分光光度计法(QHS)
脾脏B细胞 ＋SRBC＋ 补体
成抗原抗体复合物，激活补 体系统，裂解SRBC而释放
补体经典激活途径
出血红蛋白，以分光光度计 定量测定。所测值反映了抗
SRBC裂解
体形成细胞产生抗体的功能。
分光光度计检测
2
实验步骤
❖ SRBC及其制备 脱纤维防凝处理的SRBC，以NS洗涤二次，
每次2000rpm 离心5min。弃上清，制成 SRBC悬液，然后用血细胞计数板计数细胞， 最后稀释成1.5×108 sRBC/ml。
时间也要严格控制。
7
细胞计数法
WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
细胞浓度/ml
= 4个大方格中的细胞总数/4 × 104
RBC
细胞浓度/ml
= 5个中方格中的细胞总数 ×5 ×1804
W
W
1mm
W
W
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml
细胞浓度: 细胞数/ml =5个中格的细胞数 ×5×104（RBC计数法）
细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 ×104 （WBC计数法） 9
抗体制备
原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B细
胞活化并分化为浆细胞，产生针对特定 抗原的特异性抗体。
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方法
❖ 1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量
❖ 2.加2-3倍体积生理盐水，混匀，2000rpm离 心5分钟，小心吸尽上清。
实验管 1ml
1ml
1ml
—
3ml
3. 混匀，37℃水浴1小时。 4. 3000rpm 离心 5 min，取上清 5.721分光光度计测413nm处OD值（Hb 量）
抗体产生的原理
抗体产生的原理
抗体产生的原理是通过机体的免疫系统来应对外来入侵的病原体。
当病原体进入机体后，机体的免疫系统会识别它们并进行相应的应激反应。
其中，B细胞是主要的抗体产生细胞。
抗体产生的过程可以分成两个阶段：抗原刺激和抗体合成。
首先，当病原体进入机体后，它们的特异抗原会被识别并结合到B细胞上，即抗原刺激。
这个过程受到细胞介导免疫应答
和体液介导免疫应答两种机制的调控。
在接收到抗原刺激后，B细胞会进一步分化为两种形式：浆细
胞和记忆B细胞。
浆细胞是一种专门合成和分泌抗体的细胞，而记忆B细胞则会长期保存在体内，以便在再次遇到相同病
原体时迅速产生抗体。
接下来是抗体合成的过程。
在细胞内，B细胞会通过基因重组
产生特异性的抗体基因，进而合成相应的抗体蛋白。
这些抗体蛋白通过分泌出B细胞表面的免疫球蛋白M（IgM）进入体液循环，并与抗原结合形成抗原-抗体复合物，从而中和或清除
病原体。
值得一提的是，抗体的产生不仅能够应对外来病原体，在疫苗接种后也能够提供免疫保护。
疫苗中的抗原刺激可激活B细
胞并诱导抗体产生，从而让机体在未来遇到相同病原体时能够更快产生抗体，有效预防疾病。
总而言之，抗体产生的原理是通过机体免疫系统的反应，识别并结合到病原体抗原，进而分化为合成抗体的浆细胞和保存在体内的记忆B细胞，最终产生特异性的抗体来应对外来入侵的病原体。
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
免疫系统的抗体产生
免疫系统的抗体产生免疫系统是人体的自我保护系统，在遭受外界病原体侵害时起到至关重要的作用。
其中，抗体是免疫系统中的重要组成部分，可以有效地抵御病原体的侵袭。
本文将详细介绍免疫系统中抗体的产生过程，包括抗原刺激、B细胞的活化和分化、抗体的合成和分泌等。
1. 抗原的识别与激活免疫系统的抗体产生始于抗原的识别与激活过程。
当外部病原体侵入人体后，其表面的特定分子被免疫系统识别为抗原。
这些抗原能够与人体免疫系统中的特定抗原受体结合，进而激活免疫系统的应激反应。
2. B细胞的活化和分化一旦抗原与抗原受体结合，B细胞被激活并开始分化。
激活的B细胞将经历克隆扩增，产生大量功能相似的B细胞克隆群体。
这些克隆细胞中，部分将发展成为抗体分泌细胞，而另一部分则将作为记忆细胞储备在体内，以备后续感染的再次出现。
3. 抗体的合成和分泌活化分化的B细胞进一步发育成为抗体分泌细胞，也就是我们常说的浆细胞。
这些浆细胞能够合成和分泌大量的抗体，以对抗感染源。
抗体主要由两个基本结构单元组成：重链和轻链。
它们通过特定的氨基酸序列连结在一起，形成完整的抗体分子。
合成的抗体分子随后被积累在免疫系统的不同组织中，包括淋巴结、脾脏和黏膜等。
4. 抗体的功能与作用机制抗体在免疫系统中起到多种功能与作用机制。
首先，抗体可以直接与病原体结合，防止其进一步侵入人体细胞，从而起到阻断感染的作用。
其次，抗体能够激活免疫系统中的其他细胞，如巨噬细胞和NK细胞，促进它们对病原体的清除。
此外，抗体还能够参与药物的清除和控制炎症反应等。
总结起来，免疫系统的抗体产生是一个复杂而精确的过程。
从抗原的识别与激活开始，到B细胞的活化分化，再到抗体的合成和分泌，每个环节都与特定的分子相互作用，以确保抗体的产生和功能的发挥。
通过这些过程，免疫系统能够有效地应对外部病原体的威胁，维护人体的免疫健康。
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实验方法——补体制备
豚鼠心脏取血，分离血清。稀释成1：8，备 用。
实验方法——SRBC制备
取羊颈静脉血，生理盐水洗涤3次，制备成25% 的羊血备用。
试验方法——制备PFC
取脾细胞50μL，SRBC 50μL，补体50μL混合， 用1640补充到500μL，混合均匀。 微量加样器将混合液注入事先制备好的小室中。 每室约100μL，37°C的温箱中1-2小时，观察 结果。可借助显微镜观察。
体外抗体形成细胞检查
医学免疫学教研室
实验目的
掌握小鼠脾细胞的制备方法。 了解体外抗体形成细胞的检查。
实验原理
将一定量洗涤过的绵羊红细胞静脉或腹腔注射 小鼠，注射后4天将小鼠杀死，制成脾细胞悬 液，内含抗体形成细胞（PFC）. 将脾细胞、绵羊红细胞及补体混合孵育，由于 PFC分泌的抗体与绵羊红细胞（抗原）结合形 成IC，激活补体，可形成肉眼可见的空斑。 是机体免疫状态的指标。特异性高，简单，好胶制备的小室。 绵羊红细胞 补体（豚鼠血清） 细胞营养液（1640） 微量加样器 PH=7.2的PBS 小平皿
实验方法——免疫小鼠
5%的SRBC0.1mL注射小鼠腹腔，4天后处死。
实验方法——制备脾细胞悬液：
1.
2.
3. 4. 5.
取出脾脏，用1支5mL和1支2mL注射器在含有2mL PBS的小平皿中刮出脾细胞。 用2mL注射器抽吸刮出的脾细胞3-5次，使脾细 胞尽量分散。 用约8mLPBS洗涤脾细胞3次；每次1000转，10分 钟。 最后将沉淀细胞悬浮于1mL1640液中。 细胞计数，配成2-3×107/mL，备用。