第二十二章 免疫学检测技术的基本原理
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第二十二章 免疫学检测技术的基本原理
本科免疫学POWERPOINT讲稿 免 疫 诊 断
1. 直接凝集：玻片和试管凝集 直接凝集： 2 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集。 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集 间接凝集和反向间接凝集。 补充介绍： 补充介绍： 3. 协同凝集：以SPA为载体的反向间接ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ集。 协同凝集： 为载体的反向间接凝集。 为载体的反向间接凝集 在微生物检测中常用。 在微生物检测中常用。 4. 间接凝集抑制试验： 间接凝集抑制试验：
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P232
生物素-抗生物素蛋白系统 （2） BAS-ELISA:生物素 抗生物素蛋白系统（biotin） 生物素 抗生物素蛋白系统（ avidin system, BAS）, 放大系统。 ） 放大系统。 （3）微粒捕获酶免疫分析技术：用于检测微量可溶性抗 ）微粒捕获酶免疫分析技术： 原。 (4) 酶免疫组化法： 酶免疫组化法： 对抗原进行定性、定量、定位检测。 对抗原进行定性、定量、定位检测。 3 放射免疫测定法： 放射免疫测定法： 敏感度可达pg水平 常用于检测微量物质， 水平。 敏感度可达 水平。常用于检测微量物质，如胰岛 素、生长激素、甲状腺素、吗啡、地高辛药物和IgE等。 生长激素、甲状腺素、吗啡、地高辛药物和 等
5 免疫比浊 （immunoephelometry） ） 在一定量抗体中分别加入递增量的 抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊， 抗原，经一定时间形成 ，液体浑浊， 用浊度计测反应体系的浊度， 用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲 线推算样品中抗原含量。 线推算样品中抗原含量。
本科免疫学POWERPOINT讲稿 免 疫 诊 断
3
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ff22免疫学检测技术基本原理
阶段性：特异性结合阶段：几秒~几分钟
可见反应阶段： 几分钟~几小时~几十小时
5
影响抗原抗体反应的主要因素：
▪ Ag与Ab的浓度、 比例
▪电解质: 0.85%NaCl
▪温度: 370C
▪酸碱度: pH=6-8
前带
等价带
后带
Ag –Ab
复 合 物
Ag浓度
6
抗原与抗体的种类： 抗原的类型：
颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球/珠 可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合
稀释 全血
分离液
稀释 血浆
PBMC 粒细胞
RBC
33
（二）T、B细胞的纯化： 贴壁法——去除单核细胞 花环沉降法、尼龙毛法——分离T、B细胞
（三）免疫磁珠分离法： （四）FACS分离法：
34
二、T细胞数量检测： 1、E花环试验：
原理：T细胞均有CD2分子，而B细胞无; 将SRBC与人外周血淋巴细胞混合; SRBC可结合于T细胞周围形成花环细胞。
9
1、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应
抗体直接结合所出现的凝集现象 ：
（1）玻片法—定性试验：已知 Ab 未知 Ag(?) ABO血型鉴定， 细菌种属抗原型别的鉴定
+
10
（2）试管法—半定量试验： 诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”
病人血清 倍比稀释
伤寒细菌悬液
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 对照
第二十二章 免疫学检测 技术的基本原理
1Leabharlann 主要内容抗原和抗体的体外实验 免疫细胞功能的测定
2
免疫学检测技术： 运用免疫学原理设计的检测方法 可用于： 诊断免疫相关性疾病 探讨发病机制 监测病情和治疗效果
可见反应阶段： 几分钟~几小时~几十小时
5
影响抗原抗体反应的主要因素：
▪ Ag与Ab的浓度、 比例
▪电解质: 0.85%NaCl
▪温度: 370C
▪酸碱度: pH=6-8
前带
等价带
后带
Ag –Ab
复 合 物
Ag浓度
6
抗原与抗体的种类： 抗原的类型：
颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球/珠 可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合
稀释 全血
分离液
稀释 血浆
PBMC 粒细胞
RBC
33
（二）T、B细胞的纯化： 贴壁法——去除单核细胞 花环沉降法、尼龙毛法——分离T、B细胞
（三）免疫磁珠分离法： （四）FACS分离法：
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二、T细胞数量检测： 1、E花环试验：
原理：T细胞均有CD2分子，而B细胞无; 将SRBC与人外周血淋巴细胞混合; SRBC可结合于T细胞周围形成花环细胞。
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1、直接凝集反应： 天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应
抗体直接结合所出现的凝集现象 ：
（1）玻片法—定性试验：已知 Ab 未知 Ag(?) ABO血型鉴定， 细菌种属抗原型别的鉴定
+
10
（2）试管法—半定量试验： 诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”
病人血清 倍比稀释
伤寒细菌悬液
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 对照
第二十二章 免疫学检测 技术的基本原理
1Leabharlann 主要内容抗原和抗体的体外实验 免疫细胞功能的测定
2
免疫学检测技术： 运用免疫学原理设计的检测方法 可用于： 诊断免疫相关性疾病 探讨发病机制 监测病情和治疗效果
免疫学检验的基本原理与方法
免疫学检验的基本原理与方法免疫学检验是一种常见的实验室技术，在医学、生物学等领域具有广泛的应用。
本文将介绍免疫学检验的基本原理和常用的方法，并探讨其在疾病诊断、病毒检测和药物研发中的应用。
一、免疫学检验的基本原理免疫学检验基于机体免疫系统的特性，利用抗原与抗体之间的特异性结合反应来检测和定量分析抗原或抗体的存在。
其基本原理如下：1. 特异性识别：抗体可以识别并结合与之对应的抗原，形成特异性的抗原-抗体复合物。
2. 高度敏感性：免疫学检验可以检测极低浓度的抗原或抗体，提供高度敏感的结果。
3. 双重验证：通过采用一对互补的抗原和抗体，可以用于验证检测结果的准确性。
二、常见的免疫学检验方法在免疫学检验中，常用的方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫印迹（Western Blotting）、免疫荧光等。
下面将对这些方法进行具体介绍：1. 酶联免疫吸附实验（ELISA）ELISA是一种常见且广泛应用的免疫学检验技术。
它利用酶标记的抗体与待检测样品中的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标记物复合物。
通过添加底物，酶标记物能够催化底物的反应，产生可测量的信号。
ELISA可用于定量或半定量测定目标物的浓度，并可应用于多种领域，如感染性疾病的诊断、蛋白质的定量等。
2. 免疫印迹（Western Blotting）免疫印迹是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学技术。
该方法通过将复杂的蛋白质混合物经SDS-PAGE电泳分离后，将之转移到固体载体上。
然后，用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过酶标记的二抗与一抗结合，产生可见的信号。
免疫印迹可用于诊断疾病、检测蛋白质相对分子质量和检测表达水平等。
3. 免疫荧光免疫荧光是一种利用抗体对荧光染料标记的抗原进行特异性识别的免疫学技术。
该技术通过与荧光探针结合并激发荧光信号，来检测细胞或组织中特定抗原的定位和表达。
免疫荧光广泛应用于免疫组织化学、细胞信号转导、病毒感染等领域，可用于研究细胞和组织的结构、功能以及疾病的发生机制。
免疫学检测技术的基本原理及其应用PPT
免疫反应链
了解单克隆和多克 隆抗体在免疫反应 中的作用。
信号放大
揭示检测技术如何 利用信号放大机制 来增强检测敏感性。
检测方法
介绍常见的免疫学 检测方法，如 ELISA、免疫印迹 和流式细胞术。
免疫学检测技术的主要应用领域
探索免疫学检测技术在医学领域中的主要应用领域，包括诊断疾病、疫苗开发和药物监测。
1 定义
免疫学检测技术是一组用于检测和测量免疫反应的实验细胞生物学的深入研究。
免疫学检测技术的基本原理
深入了解免疫学检测技术的基本原理和机制，包括抗原-抗体相互作用、免疫反应链、信号放大和检测 方法。
抗原-抗体相 互作用
抗原与特定抗体之 间的相互作用是这 些技术的基础。
诊断疾病
了解免疫学检测技术在早期疾病诊断和监测中的重要作用。
疫苗开发
探索免疫学检测技术在疫苗研发和效力评估中的应用。
药物监测
了解如何利用这些技术来监测药物治疗的有效性和副作用。
免疫学检测技术的具体方法和步骤
深入了解免疫学检测技术的具体方法和步骤，包括样本收集、试剂准备、标记和检测分析。
1
样本收集
收集样本是免疫学检测的第一步，通常涉及血液、尿液或组织样本。
免疫学检测技术在医学领域的应用案例
探索免疫学检测技术在医学领域中的实际应用案例，包括癌症诊断、自身免疫疾病和传染病。
癌症诊断
了解如何利用免疫学检测技术 来识别和分类不同类型的癌症 细胞。
自身免疫疾病
探索免疫学检测在自身免疫疾 病诊断和治疗中的关键作用。
传染病
了解免疫学检测技术在传染病 预防、控制和治疗中的应用。
免疫学检测技术的基本原 理及其应用
本演示文稿将介绍免疫学检测技术的基本原理及其在医学领域中的应用。了 解这些关键概念和案例将有助于您更好地理解和应用免疫学检测技术。
免疫学检测技术基本原理
抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
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双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、部 分相同或完全不同，抗原纯度 鉴定
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免疫电泳
存在于不同区域的抗原 与抗体结合，在比例适宜处 形成沉淀弧。
沉淀弧的数量、位置和 形状与标准品相对比，可分 析样品的成分及其性质。
18
三、免疫标记技术(immunolabeling techniques)
肽-MHC四聚体技术
B细胞功 能测定
抗体含 量测定 溶血空 斑试验
免疫细胞 功能测定
细胞毒 试验
吞噬功 能测定
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
硝基蓝四 氮唑试验
巨噬细胞 吞噬试验
细胞因 子检测
生物活性 检测法 免疫学检
测法
29
一、免疫细胞的分离
稀释 血液
淋巴细胞分
离心
离液(葡聚糖
13
二、沉淀反应（precipitation reactions）
定义： 可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在条件下 结合，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
14
可在液体/半固体琼脂中进行。 包括： 1.单向琼脂扩散（可溶性抗原定量） 2.双向琼脂扩散 3.免疫电泳
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单向琼脂扩散
用于确定
Ab in gel
将抗原抗体反应与标记技术相结合，将已 知的抗体或抗原标记上失踪物质，通过检测标 记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类试验方 法。
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常用的标记物：
酶 荧光素 放射性元素 胶体金 化学发光物质等
常用免疫学检验技术的基本原理
常用免疫学检验技术的基本原理免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。
由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。
由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。
免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。
最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。
这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。
单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。
利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。
免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。
然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。
然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。
上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。
比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。
该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。
免疫印迹法则首先通过电泳分离标准的已知抗原，然后将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，浸于待测血清中。
免疫学检测技术的基本原理2012
免疫吸附分离法
anti-CD4 anti-CD4
加入淋巴 细胞悬液
anti-CD4
弃上清
免疫磁珠法:应用较广泛 是一种特异性分离所需淋巴细胞的
方法。首先将特异性抗体（如抗CD3、抗 CD4或抗CD8等）吸附在磁性微珠上，与 待测细胞悬液中的相应细胞特异性结合 后,再将磁珠结合细胞与未结合磁珠细胞 分开，即可获得纯度高的所需细胞。
（一）协助诊断感染性疾病 （二）协助诊断肿瘤 （三）协助诊断免疫系统疾病 （四）进行免疫学监测
思考题
1.解释名词 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术
2.可用哪些方法定量检测血液标本中的抗原？ 3.可用哪些方法检测组织中的抗原？ 4.HIV、HBV感染者的诊断和病情监测可用哪 些方法?
凝集反应原理图解（一）
★双向免疫扩散的应用 应用：根据沉淀线的数目和形状可
对抗原或抗体进行定性检测、组分
分析等。
★对流免疫电泳可检测： 血液中的HBsAg和AFP
★免疫比浊法主要用于： 血清蛋白及抗体成分的分析研究
抗原或抗体的检测
3.免疫标记技术 用荧光素、酶、同位素等标记抗
体或抗原用以测定相应抗原或抗体的 技术称为免疫标记技术。 特点：敏感、特异、快速，能定性、 定量、定位。
凝集反应原理图解（二）
凝集反应原理图解（三）
单向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验
免疫电泳 (immunoelectrophoresis)
对流免疫电泳
火箭电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关。
测吸光度
免疫荧光技术
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
测定标本中抗体含量。 (2)抗体形成细胞测定试验：
免疫检测技术的基本原理
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
酶
底物
辣根过氧化物酶
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
分别洗涤 除去未结合
的成分
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
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1、速率散射比浊法/免疫比浊法 在一定量抗体中分别加入相应递增量的
可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不 等的免疫复合物，使反应体系呈现不同 的浊度。用浊度计测量反应液体的浊度， 复合物形成越多，浊度越高。 常用于检测免疫球蛋白（IgG、IgM、 IgA）和补体的含量。
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2、单向琼脂扩散 将一定浓度的已知抗体混合于已熔化的琼
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1、直接凝集反应：颗粒性抗原本身直接 与相应抗体反应出现的凝集现象。
（1）玻片法：是一种定性试验，可用已 知抗体检测未知抗原，常用于菌种鉴定 或人类ABO血型的鉴定等。
（2）试管法：是一种半定量试验，常用 于检测抗体的滴度或效价，如诊断伤寒 或副伤寒的肥达反应。
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2、间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体 先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒， 然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的 凝集现象，称为间接凝集反应。
抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、 溶解反应、补体结合反应和中和反应等。
抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检 测未知的抗原；
也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标
记技术、发光免疫分析等免疫标记技术 提高了抗原抗体反应的敏感性。
3
一、抗原抗体反应的特点
1、高度特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性，这
将已知抗原吸附在载体颗粒上的称为正向 间接凝集试验；将已知抗体吸附在载体颗 粒上的称为反向间接凝集试验。
可用于测定细菌、病毒等病原微生物抗原 或抗体或某些自身抗体。
15
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二、沉淀反应 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶
性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可 见的沉淀物，称为沉淀反应。 沉淀反应可在液体中进行，也可在半固 体琼脂凝胶中进行。
26Leabharlann 272829
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补体结合反应 （Complement Fixation, CFT)
敏感性和特异性均较高，但该试验影响因 素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势32。
三、免疫标记技术 免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术
相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。 将已知的抗体或抗原标记上示宗物质，通过
种特异性是由抗原表位与抗体分子中的 超变区互补结合所决定的。 利用这一特点，在体外可对许多未知的 生物学物质进行特异性鉴定。 可用已知的抗体或抗原检测未知的抗原 或抗体。
4
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2、表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主
要以氢键、静电引力、范德华力和疏水 键等分子表面的化学基团之间的非共价 方式结合。 这种非共价键不如共价键结合稳定，易 受温度、酸碱度和离子强度的影响而解 离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特 性。
免疫学检测技术 的基本原理
1
利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术 主要应用于对多种免疫性疾病（感染性 疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免 疫病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、 疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原 性物质或免疫细胞的定性、定量，对细 胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。
2
第一节 体外抗原抗体结合反应的 特点及影响因素
6
解离度主要取决于两个方面： 一是抗体与抗原结合的亲和力（抗体分
子单一抗原结合部位与一个相应抗原表 位之间互补结合的强度）； 二是抗原抗体反应的环境因素如温度、 酸碱度和离子强度。
7
3、适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反
应取决于两者适当的浓度和比例。 在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度
11
2、温度 适当提高反应的温度可增加抗原抗体分
子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的 形成。 通常抗原抗体反应的最适温度为37℃。
3、酸碱度 抗原抗体反应的最适酸碱度为PH6~8之
间。
12
第二节 检测抗原和抗体的体外试验
一、凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原
的颗粒状物质与相应的抗体在电介质存在 的条件下结合 ，出现肉眼可见的凝集团现 象，称为凝集反应。
脂中，制成凝胶板。间隔适当的距离打孔， 加入待测可溶性抗原，使其向四周扩散。 抗原与琼脂中的抗体相遇，一定时间后， 在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可从标 准曲线中查出样品中抗原的含量。 本法常用于测定血清中免疫球蛋白（IgG、 IgM、IgA）、补体（C3）和AFP的含量。
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单向琼脂扩散 含抗体的凝胶
沉淀环
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3、双向琼脂扩散 将琼脂熔化制成琼脂平板，按需要打孔并分别
加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂中向四周 扩散，当两者比例适宜时，在抗原和抗体孔之 间形成白色沉淀线。 根据沉淀线的形状，可鉴定两者抗原是完全相 同、部分相同或完全不同。 本法常用于抗原或抗体的定性、定量检测及组 分分析。
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双向琼脂扩散
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4、免疫电泳 将样品在琼脂板上作蛋白电泳，将不同分
子量的蛋白组分分开，然后沿电泳方向挖 一平行的小槽，加入相应的抗体。存在于 不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜 处形成沉淀弧。 沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对 比，可分析样品的成分及其性质。 常用于血清蛋白的组分分析，以观察免疫 球蛋白的异常增多或缺失。
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二、抗原抗体反应的影响因素
1、电介质
抗原抗体通常为蛋白质分子，等电点分 别为pH3～5和pH5～6不等，在中性或弱 碱性条件下，表面带有较多的负电荷， 适当浓度的电解质会使他们失去一部分 负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝 集团块或沉淀物。
实验中通常用0.85%的Nacl或其他离子溶 液作为稀释液，以提供适应浓度的电解 质。
和比例适当，则抗原抗体复合物体积大、 数量多，出现肉眼可见的反应。 若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体 积小、数量少，不能出现肉眼可见的反 应。
8
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4、抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体反应可分为两个阶段： 第一阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗
原分子与抗体分子之间是互补的非共价结 合，该反应迅速，一般不出现肉眼可见的 反应。 第二阶段是可见反应 阶段，是小的抗原抗 体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大 复合物的过程。
1、速率散射比浊法/免疫比浊法 在一定量抗体中分别加入相应递增量的
可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不 等的免疫复合物，使反应体系呈现不同 的浊度。用浊度计测量反应液体的浊度， 复合物形成越多，浊度越高。 常用于检测免疫球蛋白（IgG、IgM、 IgA）和补体的含量。
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2、单向琼脂扩散 将一定浓度的已知抗体混合于已熔化的琼
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1、直接凝集反应：颗粒性抗原本身直接 与相应抗体反应出现的凝集现象。
（1）玻片法：是一种定性试验，可用已 知抗体检测未知抗原，常用于菌种鉴定 或人类ABO血型的鉴定等。
（2）试管法：是一种半定量试验，常用 于检测抗体的滴度或效价，如诊断伤寒 或副伤寒的肥达反应。
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2、间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体 先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒， 然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的 凝集现象，称为间接凝集反应。
抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、 溶解反应、补体结合反应和中和反应等。
抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检 测未知的抗原；
也可用已知的抗原检测未知的抗体。 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标
记技术、发光免疫分析等免疫标记技术 提高了抗原抗体反应的敏感性。
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一、抗原抗体反应的特点
1、高度特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性，这
将已知抗原吸附在载体颗粒上的称为正向 间接凝集试验；将已知抗体吸附在载体颗 粒上的称为反向间接凝集试验。
可用于测定细菌、病毒等病原微生物抗原 或抗体或某些自身抗体。
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二、沉淀反应 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶
性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可 见的沉淀物，称为沉淀反应。 沉淀反应可在液体中进行，也可在半固 体琼脂凝胶中进行。
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补体结合反应 （Complement Fixation, CFT)
敏感性和特异性均较高，但该试验影响因 素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势32。
三、免疫标记技术 免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术
相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。 将已知的抗体或抗原标记上示宗物质，通过
种特异性是由抗原表位与抗体分子中的 超变区互补结合所决定的。 利用这一特点，在体外可对许多未知的 生物学物质进行特异性鉴定。 可用已知的抗体或抗原检测未知的抗原 或抗体。
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2、表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主
要以氢键、静电引力、范德华力和疏水 键等分子表面的化学基团之间的非共价 方式结合。 这种非共价键不如共价键结合稳定，易 受温度、酸碱度和离子强度的影响而解 离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特 性。
免疫学检测技术 的基本原理
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利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术 主要应用于对多种免疫性疾病（感染性 疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免 疫病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、 疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原 性物质或免疫细胞的定性、定量，对细 胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。
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第一节 体外抗原抗体结合反应的 特点及影响因素
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解离度主要取决于两个方面： 一是抗体与抗原结合的亲和力（抗体分
子单一抗原结合部位与一个相应抗原表 位之间互补结合的强度）； 二是抗原抗体反应的环境因素如温度、 酸碱度和离子强度。
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3、适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反
应取决于两者适当的浓度和比例。 在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度
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2、温度 适当提高反应的温度可增加抗原抗体分
子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的 形成。 通常抗原抗体反应的最适温度为37℃。
3、酸碱度 抗原抗体反应的最适酸碱度为PH6~8之
间。
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第二节 检测抗原和抗体的体外试验
一、凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原
的颗粒状物质与相应的抗体在电介质存在 的条件下结合 ，出现肉眼可见的凝集团现 象，称为凝集反应。
脂中，制成凝胶板。间隔适当的距离打孔， 加入待测可溶性抗原，使其向四周扩散。 抗原与琼脂中的抗体相遇，一定时间后， 在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可从标 准曲线中查出样品中抗原的含量。 本法常用于测定血清中免疫球蛋白（IgG、 IgM、IgA）、补体（C3）和AFP的含量。
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单向琼脂扩散 含抗体的凝胶
沉淀环
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3、双向琼脂扩散 将琼脂熔化制成琼脂平板，按需要打孔并分别
加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂中向四周 扩散，当两者比例适宜时，在抗原和抗体孔之 间形成白色沉淀线。 根据沉淀线的形状，可鉴定两者抗原是完全相 同、部分相同或完全不同。 本法常用于抗原或抗体的定性、定量检测及组 分分析。
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双向琼脂扩散
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4、免疫电泳 将样品在琼脂板上作蛋白电泳，将不同分
子量的蛋白组分分开，然后沿电泳方向挖 一平行的小槽，加入相应的抗体。存在于 不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜 处形成沉淀弧。 沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对 比，可分析样品的成分及其性质。 常用于血清蛋白的组分分析，以观察免疫 球蛋白的异常增多或缺失。
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二、抗原抗体反应的影响因素
1、电介质
抗原抗体通常为蛋白质分子，等电点分 别为pH3～5和pH5～6不等，在中性或弱 碱性条件下，表面带有较多的负电荷， 适当浓度的电解质会使他们失去一部分 负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝 集团块或沉淀物。
实验中通常用0.85%的Nacl或其他离子溶 液作为稀释液，以提供适应浓度的电解 质。
和比例适当，则抗原抗体复合物体积大、 数量多，出现肉眼可见的反应。 若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体 积小、数量少，不能出现肉眼可见的反 应。
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4、抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体反应可分为两个阶段： 第一阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗
原分子与抗体分子之间是互补的非共价结 合，该反应迅速，一般不出现肉眼可见的 反应。 第二阶段是可见反应 阶段，是小的抗原抗 体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大 复合物的过程。