糖尿病小鼠心肌组织microRNA表达谱分析

・１１９４－上海交通大学学报（医学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖ０１．３０Ｎｏ．１０Ｏｃｔ．２０１０文章编号：１６７４—８１１５（２０１０）１０—１１９４—０５糖尿病小鼠心肌组织ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达谱分析刁雪红。

申锷，胡兵，张跃力。

吴作辉。

魏聪（上海交通大学附属第六人民医院超声医学科上海超声医学研究所心血管病实验室，上海２００２３３）・论著・摘要：目的观察中晚期糖尿病模型小鼠心肌组织ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）表达，对差异ｍｉＲＮＡ调控的靶基因进行初步预测。

方法１５只Ｃ５７小鼠经腹腔一次性注射链脲佐菌素（ＳＴＺ）建立糖尿病小鼠模型（模型组，ｎ＝１５），以１０只未建模小鼠作为对照组。

建模后８周末，超声心动图检测小鼠心脏功能指标．包括左室射血分数（ＥＦ）、左室短轴缩短率（ＦＳ）和左心室质量指数（ＬＶｗＩ）。

动物处死后留取并制备心肌组织标本，ＨＥ染色光学显微镜观察心肌细胞形态，并结合相关软件定量分析心肌细胞面积改变；采用微距阵基因芯片技术筛选糖尿病模型小鼠心肌组织差异表达的ｍｉＲＮＡ，Ｒｅａｌ—ＴｉｍｅＰＣＲ验证结果，并对差异ｍｉＲＮＡ调控的靶基因进行生物信息学分析。

结景建模８周末，超声心动图检测显示，模型组小鼠ＥＦ和Ｆｓ明显小于对照组，ＬＶＷＩ显著大于对照组；差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

组织学观察发现，模型组小鼠心肌细胞肥大明显。

基因芯片检测并经Ｒｅａｌ—ＴｉｍｅＰＣＲ验证发现，模型组小鼠心肌组织中有１６个差异表达的ｍｉＲＮＡ，其中ｍｉＲ一１９５、ｍｉＲ一１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－７００、ｍｉＲ一１４２－３ｐ、ｍｉＲ一２４、ｍｉＲ．２ｌ、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ．４９９—３Ｐ、ｍｉＲ一２０８ａ、ｍｉＲ．７０５表达上调，ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－ｌ、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ一１４３、ｍｉＲ一２０ａ、ｍｉＲ一２２０ｂ表达下调。

生物信息学分析发现，差异ｍｉＲＮＡ调控的靶基因与细胞增殖、凋亡、糖代谢及血管生成等牛物学功能相关。

结论ＳＴＺ诱导的中晚期糖尿病模型小鼠心肌组织ｍｉＲＮＡ表达谱发生明显改变，提示ｍｉＲＮＡ可能参与糖尿病心肌损伤过程。

关键词：ｍｉｃｒｏＲＮＡ；糖尿病；心肌损伤；微距阵基因芯片ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４．８１１５．２０１０．１０．００３中图分类号：Ｒ３３１．３ｌ；Ｒ５８７．１文献标志码：ＡＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅＤＩＡＯＸｕｅ－ｈｏｎｇ，ＳＨＥＮＥ，ＨＵＢｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｕｅ—ｌｉ，ＷＵＺｕｏ－ｈｕｉ，ＷＥＩＣｏｎｇｒＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｌｔｒａｓｏｕｎｄｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＵｌｔｒａｓｏｕｎｄｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｈｅＳｉｘｔｈＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ｉｎｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆａｄｖａｎｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅａｎｄｔｏｍａｋｅａｎｉｎｉｔｉａｌｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｍｉＲＮＡ．ＭｅｔｈｏｄｓＦｉｆｔｅｅｎＣ５７ｍｉｃｅｗｅｒｅｇｉｖｅｎｓｉｎｇｌｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ）ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｄｉａｂｅｔｉｃｍｏｄｅｌｓ（ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ）．Ａｎｏｔｈｅｒ１０ｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｗｅｒｅａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ（ＥＦ），ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ（ＦＳ），ａｎｄｌｅｆｔｖｅｎｔｆｉｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｉｎｄｅｘ（ＬＶＷＩ），ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄｆｏｒｍａｋｉｎｇｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎ，ｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｕｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄｃｈａｎｇｅｏｆｃｅｌｌｓｉｚｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｍｉＲＮＡｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ・ＰＣＲ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｍｉＲＮＡｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ＲｅｓｕｌｂＡｔｔｈｅｅｎｄｏｆ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＥＦａｎｄＦＳｉｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｂｕｔＬＶＷＩｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒ（Ｐ＜０．０５）．Ｕｎｄｅｒｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｃａｒｄｉａｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｓｈｏｗｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１６ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｍｉｅｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１０ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（ｍｉＲ一１９５，ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ，ｍｉＲ－７００，ｍｉＲ一１４２－３ｐ，ｍｉＲ－２４，ｍｉＲ－２１，ｍｉＲＮＡ一２２１，ｍｉＲ－４９９－３ｐ，ｍｉＲ－２０８ａ，ａｎｄｍｉＲ－７０５）ａｎｄ６ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（ｍｉＲ・２９ａ，ｍｉＲ一１，ｍｉＲ－３７３，ｍｉＲ・１４３，ｍｉＲ一２０ａ，ａｎｄｍｉＲ－２２０ｂ）．ＴｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍｉＲＮＡｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｇｌｙｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＭｉＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｓｏｆＳＴＺｉｎｄｕｃｅｄａｄｖａｎｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｈａｎｇｅｓ，ｗｈｉｃｈｍａｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｗａｒｄｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｄｉａｂｅｔｅｓ；ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ；ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ基金项目：上海市浦江人才计划（０９Ｐｊｌ４０８４００）（Ｓｈａｈ【ｇｈａｉＰｕｊｉａｎｇＰｒｏｇｒａｍ．Ｃｈｉｎａ，０９ＰＪｌ４０８４００）。

作者简介：刁雪红（１９８３一），女，博士生；电子信箱：ｘｕｅｈｏｎ９８１９＠ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ．ｃｎ。

通讯作者：申锷。

电子信箱：ｓｈｅｎｅｌＯＯｌ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｅｏｎｌ。

万方数据刁雪红，等：糖尿病小鼠心肌组织ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达谱分析糖尿病心肌病作为糖尿病独立并发症目前已被肯定且日益受到重视，它是导致心脏功能衰竭的重要原因，也是糖尿病群体特别是老年男性和绝经后女性患者高病死率的重要原因。

目前已确定了一些关键基因和信号途径参与了糖尿病心肌病的病理过程，但其发病机制并未完全阐明…。

ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是～类内源性、具有２２个左右核苷酸大小的非编码ＲＮＡ分子，在进化中呈现高度保守性，通过碱基匹配原则识别靶基因３’非翻译区（３’ＵＴＲ）的靶位点，从而抑制编码蛋白靶基因的翻译和（或）降解靶基因旧Ｊ。

研究＂ｏ发现，ｍｉＲＮＡ在正常人和心脏疾病患者的心肌组织中有特征性表达，不仅在调控心肌细胞的分化和发育中起苇要作用，在心血管系统的病理生理过程中同样不可或缺。

本研究通过建立糖尿病动物模型，运用基因芯片技术检测心肌组织中差异ｍｉＲＮＡ表达，初步探讨ｍｉＲＮＡ在１型糖尿病心肌病病理过程中的作用。

１材料与方法１．１材料１．１．１动物及分组２５只８周龄雄性Ｃ５７小鼠，体质量２３—２５ｇ；随机分为糖尿病模型组（，ｌ＝１５）和对照组（ｒ／，＝１０）。

所有动物由中国科学院上海实验动物中心提供，动物生产许可证和使用许可证号码分别为ＳＣＸＫ（沪）２００７—０００５和ＳＣＸＫ（沪）２００６—００１０）。

１．１。

２主要试剂和仪器链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ，ＳＴＺ）、ＴＲＩｚｏｌ试剂（Ｓｉｇｍａ，美国）；Ｓｏｎｏｓ５５００超声诊断系统（探头频率１４ＭＨｚ）（Ｐｈｉｌｉｐｓ，美国）；ＴａｑＭａｎ＠ＭｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙｓ、ｍｉＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，美国）；荧光标记、芯片杂交及结果检测在北京奥博生物公司实验室完成；ＬｕｘＳｃａｎ１０Ｋ／Ａ双通道激光扫描仪、ＬｕｘＳｃａｎ３．０图像分析软件、基因芯片显著性分析（ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，ＳＡＭ）软件（ＳＡＭ３．０２）由北京博奥公司提供。

１．２方法１．２．１建立糖尿病动物模型模型组小鼠经单次腹腔注射ＳＴＺ（１５０ｍｒ，／ｋｇ）制作ｌ型糖尿病动物模型。

于ＳＴＺ注射后７２ｈ时点，经尾静脉采血用ＯｎｅｔｏｕｃｈＩＩ血糖仪检测随机血糖，若血糖水平超过１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ即确认建模成功Ｈ１。

对照组小鼠则单次腹腔注射等量生理盐水。

Ｉ．２．２心脏功能检测①超声心动图测量：于建模后８周末，对所有动物实施超声心动图测量。

将小鼠固定仰卧略向左倾斜位后获取胸骨旁短轴切面Ｍ型超声图像，测量左心室射血分数（１ｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎ，ＬＶＥＦ）和左心室短轴缩短率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔ—ｅｎｉｎｇ，ＦＳ）。

②左心室质量指数（１ｅｆｔｖｅｎｔｆｉｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｉｎｄｅｘ，ＬＶＷＩ）：小鼠处死前后分别称量体质量和左心室质量，ＬＶｗｌ＝左心室质量／体质量。