免疫共沉淀原理及其应用
免疫共沉淀技术原理和操作流程
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用 于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望
蛋白质免疫共沉淀原理
蛋白质免疫共沉淀原理蛋白质免疫共沉淀（protein immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于从混合样品中选择性地富集、分离和纯化特定的蛋白质。
该技术基于抗体与特定蛋白质之间的高度特异性结合，通过将抗体与相应的抗原结合，然后利用抗体-抗原复合物对目标蛋白质进行富集和纯化。
以下将详细介绍蛋白质免疫共沉淀的原理和应用。
蛋白质免疫共沉淀的原理基于免疫学的基本原理。
当宿主动物（如小鼠、兔子）接种抗原后，免疫系统会产生抗体来特异性识别和结合抗原。
抗体是能够与抗原特异性结合的分子，它通常由两个重链和两个轻链组成。
抗体的抗原结合位点位于其变量区域，这个区域具有高度特异性，能够识别并结合特定的抗原。
1.制备抗体：首先，需要获得特定蛋白质的抗体。
这可以通过免疫动物（如小鼠或兔子）来实现。
将目标蛋白质注射入宿主动物体内，触发免疫反应，产生特异性的抗体。
2.抗体固定：将抗体固定在适当的固相介质上，如磁珠、琼脂糖或微孔板等。
固相抗体通常被共价地连接到固相介质上，以增加固定的稳定性和特异性。
3.样品孵育：将包含目标蛋白质的混合样品与固相抗体孵育。
在这个过程中，抗体会特异性地结合目标蛋白质，形成抗原-抗体复合物。
4.共沉淀：通过离心或其他分离方法，将抗原-抗体复合物与固相结合的抗体一起沉淀下来，从而将目标蛋白质分离和富集出来。
5.洗涤：对沉淀物进行多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物。
洗涤的过程中，使用不同的缓冲液和洗涤条件，可以有效地去除非特异性结合的物质。
6.洗脱和纯化：通过改变盐浓度、pH值或其他条件，将目标蛋白质从抗体上洗脱下来。
洗脱的条件要使目标蛋白质脱离抗体而不破坏其结构和功能。
7.分析：对纯化的目标蛋白质进行进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析、酶活测定等，以确定蛋白质的身份和活性。
1.蛋白质互作研究：通过免疫共沉淀，可以捕获目标蛋白质与其相互作用的互作蛋白质。
这可以帮助研究蛋白质相互作用网络、信号传导通路等。
chirp免疫共沉淀技术
chirp免疫共沉淀技术
Chirp免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，用于研究蛋白质间的相互作用和信号传导途径。
本文将以人类的视角，描述Chirp免疫共沉淀技术的原理和应用。
Chirp免疫共沉淀技术是一种基于抗体的实验方法，用于捕捉特定蛋白质与其相互作用的伙伴。
该技术的原理是通过交联和免疫共沉淀的方法，将目标蛋白质及其结合伙伴一起捕捉下来，从而揭示它们之间的相互作用关系。
在进行Chirp免疫共沉淀实验时，首先需要对目标蛋白质进行交联。
交联是通过添加交联剂使细胞或组织中的蛋白质交联在一起，从而固定它们的位置和相互作用。
接下来，用特异性抗体对交联后的样品进行免疫沉淀。
这些抗体会选择性地结合目标蛋白质及其结合伙伴，将它们与抗体结合物一起沉淀下来。
通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最终得到目标蛋白质及其结合伙伴的复合物。
Chirp免疫共沉淀技术广泛应用于研究蛋白质相互作用和信号传导途径。
通过确定特定蛋白质与其他蛋白质的相互作用伙伴，可以揭示蛋白质网络中的信号传导途径。
此外，Chirp免疫共沉淀技术还可用于筛选药物靶点和研究疾病发生机制。
Chirp免疫共沉淀技术的优势在于其高度选择性和灵敏性。
通过使用特异性抗体，可以准确地捕捉目标蛋白质及其结合伙伴，避免了
非特异性结合的干扰。
此外，该技术还可以应用于多种样本类型，包括细胞系、动物模型和人体组织等。
Chirp免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，用于研究蛋白质相互作用和信号传导途径。
通过描述该技术的原理和应用，我们可以更好地理解蛋白质网络的复杂性，并为疾病研究和药物开发提供重要的参考。
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。
在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。
但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。
（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。
但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。
若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
免疫共沉淀试验原理及方法
免疫共沉淀试验原理及方法免疫共沉淀试验基于抗体-抗原相互作用的原理进行。
首先，通过对目标蛋白质进行免疫反应，用特异性的抗体与目标蛋白质形成抗原-抗体复合物。
然后，将抗体与目标蛋白质的复合物与磷酸化的蛋白质、蛋白质复合物或其他特定蛋白质结合，形成更大的复合物。
最后，通过沉淀这些复合物，从而使复合物分离于整个细胞提取物中。
1.固相免疫共沉淀：该方法使用固相支持材料，如蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂柱。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后将抗体与蛋白A或蛋白G结合的支持材料结合。
接下来，将细胞提取物与抗体-蛋白质复合物和支持材料一起孵育。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
2.液相免疫共沉淀：该方法使用溶液中的特异性抗体与目标蛋白质进行免疫反应。
首先，将目标蛋白质与特异性抗体免疫反应，然后添加蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖磁珠或亲和树脂，形成抗体-蛋白质复合物。
接下来，将细胞提取物加入到抗体-蛋白质复合物中，使复合物与目标蛋白质的相互作用伴侣结合。
随后，用磁力或离心将复合物分离，并通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质。
最后，用洗涤液溶解复合物，并通过离心或磁力分离来收集目标蛋白质及其相互作用伴侣。
1.直接鉴定特定蛋白质的相互作用伴侣。
2.可以识别特定蛋白质的翻译后修饰形式，如磷酸化、乙酰化等。
3.可以从复杂的细胞提取物中寻找目标蛋白质的结合伴侣。
然而，免疫共沉淀试验也存在一些局限性，包括：1.需要具有较高特异性的抗体。
2.可能产生伪阳性结果，特别是在存在非特异性结合的情况下。
3.难以从细胞提取物中完全分离复合物。
总结：免疫共沉淀试验是一种常用的实验技术，可以用于寻找细胞中特定蛋白质的相互作用伴侣或靶向蛋白的修饰形式。
根据不同的实验需求，可以选择固相免疫共沉淀或液相免疫共沉淀方法进行。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。
它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。
本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。
该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。
3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。
可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。
同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。
2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。
此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。
3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。
为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。
可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。
通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。
5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。
洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。
6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
coip免疫共沉淀的原理
coip免疫共沉淀的原理
coip免疫共沉淀（coip）是将抗体标记的抗原或抗体与样
品中的特定目标蛋白质进行特异性结合，形成抗原抗体复合物。
然后用一抗或二抗将此复合物与相应的抗体结合，在凝胶上形成
一条带，此带即为可移动的沉淀物。
与沉淀物结合的抗体可被洗脱，而未结合的抗原或抗体则可以被固定。
因此，coip免疫共
沉淀可用于分离与研究蛋白质相互作用，鉴定蛋白质及其亚基。
免疫共沉淀（coip）技术在蛋白质组学研究中应用非常广泛。
蛋白质组学是研究蛋白质序列和空间结构的学科，研究对象主要
是蛋白质本身，而不是其所结合的其他分子。
通过分析和鉴定所
需的蛋白，可以了解这些蛋白与哪些分子相结合以及它们之间的
相互作用方式，进而为蛋白质功能与结构、翻译后修饰、信号转
导以及蛋白质与其配体和受体之间相互作用等生物学过程的研究
提供有力工具。
在细胞生物学、免疫学等领域中，coip技术已
被广泛应用于基因表达调控、免疫活性调节及疾病发生机制研究
等方面。
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免疫共沉淀原理及其应用
免疫共沉淀（Immunoprecipitation，简称IP）是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质与其他生物分子的结合。
其原理是利用抗体对目标蛋白进行特异性识别，并通过与抗体结合的蛋白质一起沉淀下来，从而分离出目标蛋白及其结合的分子。
免疫共沉淀的基本步骤包括以下几个关键步骤：
1. 抗体结合：将特异性抗体与目标蛋白发生特异性结合，形成免疫复合物。
通常，抗体会提前与特定的固相载体（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）结合，以便后续步骤的操作。
2. 细胞裂解：将含有目标蛋白的细胞裂解，释放出蛋白质组分。
裂解可以使用生理盐溶液或其他细胞裂解缓冲液。
3. 共沉淀：将抗体结合的载体加入细胞裂解液中，使抗体与目标蛋白及其结合分子发生特异性结合。
通过旋转、摇动或磁力等方法，使免疫复合物与固相载体结合并沉淀下来。
4. 洗涤：通过多次洗涤的步骤，去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物，使得只有目标蛋白及其结合分子与固相载体保持结合。
5. 释放：通过改变溶液条件（如改变pH或加入脱离剂），使目标蛋白及其结合分子从固相载体上释放下来。
免疫共沉淀的应用广泛，以下是一些主要应用领域：
1. 蛋白质相互作用研究：免疫共沉淀可用于研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，帮助鉴定和验证蛋白质间的相互作用伙伴。
可以通过免疫共沉淀来确定蛋白质复合物的组成成员，研究其结构和功能。
2. 蛋白质与核酸的相互作用研究：免疫共沉淀也可用于研究蛋白质与核酸（如DNA、RNA）之间的相互作用关系。
通过免疫共沉淀，可以分离出与特定蛋白质结合的核酸分子，并进一步研究其功能和调控机制。
3. 翻译后修饰研究：免疫共沉淀可用于研究蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、泛素化等。
通过特异性抗体的使用，可以选择性地富集含有特定修饰的蛋白质，从而深入了解其在信号传导、细胞周期等生物过程中的功能和调控。
总之，免疫共沉淀是一种重要的实验技术，通过特异性抗体的利用，可以分离和富集目标蛋白质及其结合分子，为研究蛋白质相互作用和调控提供了有效的工具和方法。