免疫共沉淀技术的研究进展_郭纯
免疫共沉淀技术
骤
优
劣
应
用
优点
（ 1 ）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； （ 2 ）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； （ 3 ）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白 复合物。.
缺点
（ 1 ）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质 －蛋白质相互作用； （ 2 ）两种蛋白质的结合可能不是直接结合， 而可能有第三者在中间起桥梁作用； （ 3 ）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以 选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确， 实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 （4）灵敏度没有亲和色谱高。
河北工程大学
---医学院
免疫共沉淀技术的应用与研究
一的 班 六 其实是答辩 标 题组 地方
我们毕业啦
免疫共沉淀技术介绍 免疫共沉淀技术的步骤 免疫共沉淀技术的优劣
SYLLABUS
免疫共沉淀技术的应用
免疫共沉淀技术介绍
技术介绍
步
骤
优
劣
应
用
免疫沉淀原理图：1、样品准备 2、样品预清洗 3、抗原/抗 体孵育 4、沉淀反应 5、电泳 分析
THANKS
技术介绍
步
骤
优
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用
“
免疫共沉淀定义
免疫共沉淀（CO-IP）是以抗体和抗原之间 的专一性作用为基础的用语研究蛋白质相 互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在 完整的细胞内生理性相互作用的有效方法.
”
技术介绍
步
骤
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应
用
免疫共沉淀原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存 在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
《免疫共沉淀》课件
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
免疫沉淀 免疫共沉淀
免疫沉淀免疫共沉淀免疫沉淀和免疫共沉淀是常用的免疫学实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用以及蛋白质的表达水平。
本文将分别介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理、步骤和应用。
一、免疫沉淀免疫沉淀是通过抗体的高选择性与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体和结合的蛋白质分离出来。
其原理是利用抗体与抗原的特异性结合，形成免疫复合物，并通过沉淀剂使复合物从溶液中沉淀下来。
免疫沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠），使免疫复合物沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。
7. 分析：将沉淀的免疫复合物进行后续分析，如Western blot、质谱等。
免疫沉淀的应用：1. 确定蛋白质间的相互作用：通过沉淀目标蛋白质及其相互作用的蛋白质，可以鉴定蛋白质间的相互作用关系。
2. 鉴定蛋白质的修饰：通过沉淀修饰蛋白质及其相关蛋白质，可以鉴定蛋白质的翻译后修饰。
3. 确定蛋白质的表达水平：通过沉淀目标蛋白质及其相关蛋白质，可以确定目标蛋白质的表达水平。
二、免疫共沉淀免疫共沉淀是在免疫沉淀的基础上进行的一种技术，旨在检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、RNA）之间的相互作用。
其原理是利用抗体与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体、目标蛋白质以及与其相互作用的分子沉淀下来。
免疫共沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂，使免疫复合物及其相互作用的分子沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。
利用免疫共沉淀技术研究RSV
利用免疫共沉淀技术研究RSV呼吸道合胞病毒（RSV）是一种常见的呼吸道病毒，引起婴幼儿病毒性肺炎和支气管炎等疾病。
RSV感染具有较高的发病率和死亡率，尤其对儿童和老年人等免疫力较弱的人群危害更大。
因此，研究RSV的致病机制和抗病毒药物的研发是当前的重要课题。
本文利用免疫共沉淀技术，旨在探讨RSV感染后与人体蛋白之间的相互作用，以期为RSV致病机制的研究提供新的思路。
过去的研究主要集中在RSV的病毒结构、基因组、临床表现等方面，对于RSV与人体蛋白之间的相互作用研究较少。
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，具有较高的灵敏度和特异性。
然而，由于RSV感染的复杂性，单一的免疫共沉淀实验难以全面揭示RSV与人体蛋白之间的相互作用，因此需要进一步完善实验方法和数据分析。
免疫共沉淀技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合，将混合溶液中的目标蛋白质与其他蛋白质分离出来，经过洗脱、纯化等步骤，最终获得纯度较高的目标蛋白质。
在本研究中，我们首先确定了实验流程：RSV感染细胞→细胞裂解→免疫共沉淀实验→质谱分析→数据解读。
然后，我们根据实验流程挑选出高质量的抗体，确保抗体的特异性识别RSV抗原。
在质谱分析环节，我们采用液相色谱-质谱联用技术对获得的共沉淀物进行分析，从而确定与RSV相互作用的蛋白质。
通过免疫共沉淀实验和质谱分析，我们获得了与RSV相互作用的蛋白质清单，并进行了数据解读。
结果表明，RSV与多种人体蛋白发生相互作用，这些蛋白质主要参与细胞代谢、细胞信号转导、免疫应答等方面。
我们还发现了一些与RSV感染密切相关的蛋白质，如病毒进入细胞的相关蛋白、病毒复制所需的蛋白质等。
这些结果为深入探讨RSV的致病机制提供了有益的信息。
对实验结果进行详细分析发现，RSV与人体蛋白之间的相互作用具有以下特点：RSV与细胞膜表面的糖蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用，这有助于病毒进入细胞并在细胞内复制；RSV还与参与细胞信号转导的蛋白质相互作用，这可能干扰和破坏了正常的细胞信号转导途径，导致细胞功能异常；RSV还与免疫应答相关的蛋白质相互作用，这可能抑制了机体的免疫应答，使病毒得以在体内持续存在。
免疫共沉淀原理及实验方法
注册┆登录┆发表文章免疫共沉淀原理及实验方法2007-03-22 16:07:46大中小免疫共沉淀一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
(待续)二准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液 (最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%TritonX-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
免疫共沉淀技术的研究进展
混合 物 ， 复洗 ５次 。最后 ， Ｎ Ｔ 再重 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Ｅ Ｎ洗 １ 次。 １１６ 吸出混合物的液体部分 。加 入 ８０ 的 １ｘＳ Ｓ胶 ．． ０ Ｄ
加样缓 冲液到球珠中 ， 煮沸 ４ｍｉ。 ｎ
ｈｂ ｄｓｓ ｍ） 。另外 ， ｙｒ ｔ 等 ｉ ｙｅ 还发展 了可定性 和定量检测蛋 白
ｆ ｗ ｌ ． ａ
［ ｅ ０ｄ ］ Ｃ —ｉｍ ｎｐｅｉｉｔ ｎ Ｐｏｅ ； ｎ ｒｃｏ ； ｅｈ ｏ ｇ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｏ ｍ ｕ ｏｒｃ ｔ ｉ ； ｒ ｉ Ｉｔ ａｔ ｎ Ｔｃ ｎｌ ｐａｏ ｔｎ ｅ ｉ ｏ ｙ
［ 中图分类号］ ３ ２— ３ ［ Ｒ９ ３ 文献标识码 ］ ［ Ａ 文章编号］ ６２— ５ Ｘ（０７ １ ０ ８ —０ １７ ９ １ ２ ０ ）２— ０ ６ ４ 蛋 白质问的相互作用控制着 大量的细胞活动事件 ， 如细 胞的增殖 、 分化和死 亡。通 过蛋 白质 问相互 作用 ， 可改变 细 胞内蛋 白质的动力学特 征。如底 物结合 特性 、 催化 活性 ； 也
１１１ 用胰蛋白酶 消化胶 中的蛋 白质 ， ．．０ 再将肽电洗脱 。
１１１ 通过窄孑高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 Ａ Ｉ ．．１ Ｌ Ｂ
ｍｅ ｈ ｄ ｈ ａ ｅ ｄ ｉ ｒ ｔｒ ｅ ｉｗ，ｗ ｉｈ ｒ ｆｒｅ ｏ ｔｅ ｐ ｎ ｉ ｌ ｆＣ ｔ ｏ ．Ｔ ｅ ｐ ｐ ｒｍａ ｅ ａ ｌｔ ａｕ ｅ ｒｖ ｅ ｅ ｈ ｃ ｅｅ ｒ ｄ ｔ ｈ ｒ ｃｐ ｅ ｏ Ｏ—ｉ ￣ ｕ ｏ ｒｃｐ ｔｔ ｎ ｔｃ ｎ ｌ ｇ ｎ ｔ ｒ ｒ ｉ ｎ ｍ ｎ ｐ ｅ ｉ ｉ ｉ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ａ ｄ ｉ ｍｅｉ ｏ ａｏ ｓ ｔ
得 出的蛋 白质 问的相互作用 的结论显得更为可靠 Ｊ 。 １ 免疫共沉淀基本原理
染色体免疫共沉淀技术
染色体免疫共沉淀技术染色体免疫共沉淀技术，听起来就像是一场微观世界里的超级大侦探游戏。
你想啊，染色体就像是一座巨大无比的神秘城堡，里面藏着数不清的宝藏（基因信息）。
而我们的蛋白质呢，就像是城堡里各种各样的小精灵，它们有的在城堡里安居乐业，有的在城堡里调皮捣蛋，和不同的角落（基因区域）有着千丝万缕的联系。
这时候染色体免疫共沉淀技术就闪亮登场啦，它就像一个超酷的魔法捕手。
这个魔法捕手有一个超级厉害的网（抗体），这个网可挑剔啦，只对特定的小精灵（蛋白质）感兴趣。
一旦发现目标，就会以迅雷不及掩耳之势把小精灵给网住，那速度快得就像闪电侠附身。
然后呢，就像揪着小精灵的小辫子一样，连带把小精灵所在的那一小片城堡（和蛋白质结合的DNA片段）也一起拽出来。
这一拽可不得了，就像是从城堡的大拼图里硬生生抠出了一块小拼图。
这个被拽出来的小拼图可珍贵啦，就像是从阿里巴巴的山洞里找到的独一无二的宝藏。
它能告诉我们这个小精灵到底在城堡的哪个角落安营扎寨，又和哪些其他的小秘密（基因调控关系）有关系。
这个技术有时候又像是一场微观版的拔河比赛。
抗体和蛋白质紧紧拉住，而DNA就像是那根被拉来拉去的绳子，最后大家达成一个平衡，被成功分离出来。
如果把染色体比作浩瀚的星空，那基因就是星空中的星星，蛋白质就是围绕着星星转的小行星。
染色体免疫共沉淀技术就像是一个宇宙探索者，把小行星和它对应的星星的关系给搞清楚。
它还像是一个微观世界的红娘，把蛋白质和DNA这两个羞涩的家伙强行拉到一起，然后让我们看清楚它们到底是不是相互心仪（结合）。
在科研的大舞台上，染色体免疫共沉淀技术就是一个超级明星，很多科学家都眼巴巴地望着它，希望它能从神秘的微观世界里挖掘出更多惊人的秘密。
不过呢，这个技术也有点小脾气，就像一个傲娇的小公主。
操作起来得小心翼翼，稍微有点差池，就像踩了小公主的裙摆，整个实验可能就搞砸了。
但只要哄好了它，它就能给我们展现出微观世界里那些精彩绝伦的画面，让我们在基因和蛋白质的神秘王国里畅游。
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免疫共沉淀技术的研究进展S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y郭纯(湖南省人民医院,湖南 长沙 410005)[摘要] 免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。
文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。
[关键词] 免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术[A b s t r a c t] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w.[K e y w o r d s] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A [文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。
通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。
如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。
因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。
由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义,因此其检测方法的研究也备受重视由生化方法,如蛋自质亲和层析(p r o t e i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y)、亲和印迹(a f f i n i t yb l o t t i n g)、免疫沉淀(i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)及交联(c r o s s-l i n k i n g),发展到当今的分子生物学方法,如以基因文库为基础的蛋白探测(p r o-t e i np r o b i n g)、噬菌体显示(p h a g e d i s p l a y)及双杂交系统(t w o -h y b r i ds y s t e m)等。
另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法,如表面胞质团共振(s u r-f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e)等。
通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。
1 免疫共沉淀基本原理细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质,经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。
将包含活性物质的组织或细胞构建成c D N A文库,以上述核苷酸序列为探针从c D N A文库中分离出c D N A克隆。
1.1 免疫共沉淀技术的主要步骤1.1.1 用磷酸盐缓冲液洗30块10c m培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1m l冰冷的E B C裂解缓冲液中。
1.1.2 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15m i n。
1.1.3 收集上清(约30m l)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。
1.1.4 加入0.9m l的蛋白质A-S e p h a r o s e悬液,4℃摇动免疫沉淀物30m i n。
1.1.5 用含900m m o l/L N a C l的N E T N洗蛋白A-S e p h a r o s e 混合物,再重复洗5次。
最后,用N E T N洗1次。
1.1.6 吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×S D S胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4m i n。
1.1.7 将样品加入到大孔的不连续S D S-P A G E梯度胶中,在10m A的恒定电流下电泳过夜。
1.1.8 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
1.1.9 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m l 50%乙腈洗两次,每次3m i n。
1.1.10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
1.1.11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在A B I 477A或494A机器上进行自动E d m a n降解测序。
2 免疫共沉淀技术的应用2.1 肿瘤 鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与L C2E S I2M S/M S分析相结合的方法对H N E1细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一H S P78进行了验证。
首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要第13卷第12期 中 医 药 导 报 2007年12月V o l.13 N o.12 G u i d i n g J o u r n a l o f T C M D e c e m b e r.2007 DOI:10.13862/ 43-1446/r.2007.12.038依据和线索。
方法:在含2m g细胞总蛋白的1m l抽提缓冲液中,加入1μl正常兔血清和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B 珠子,4℃、振荡2h,9000r/m i n离心5m i n去除珠子以消除非特异结合蛋白,保留上清液。
在上清液中加入5μl兔抗人p53抗体和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B珠子,4℃,振荡过夜,9000r/m i n离心5m i n去上清液,保留珠子。
T B S T缓冲液洗涤含免疫复合物的珠子4次,每次5m i n,离心收集珠子。
以B S A取代p53抗体作为对照[2]。
人肝癌中热休克蛋白70(H S P70)与p53的相互作用:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选H S P70与p53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取之,然后用S D S-P A G E及We s t-e r nb l o t分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式。
检测到12例肝癌组织中有3例为双阳性,用抗H S P70m A b免疫共沉淀的样品,可检测到p53蛋白。
用抗p53m A b免疫共沉淀的样品也可检测到H S P70蛋白,证明人肝癌中p53与H S P70以复合物的形式而存在,此可为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的思路[3]。
肿瘤的异质性(H e t e r o g e n e i t y)是指单克隆起源的肿瘤细胞在生长过程中其侵袭能力、生长速度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面能形成不同表型亚克隆的特性[4]。
肿瘤异质性是肿瘤研究的一个重要方向,对解释肿瘤基础及临床研究中出现的诸多问题具有重要意义。
随着分子生物学技术的发展,对于肿瘤异质性的研究方法已从形态学深入到细胞生物学、分子遗传学、分子病理学等方面,但其分子水平的研究多处于基因水平,而对蛋白质方面的研究甚少。
由于蛋白质是生命活动的执行者和体现者,细胞各种重要的生理过程都是以蛋白质间相互作用来实现的,因此通过研究蛋白质的相互作用来探讨肿瘤异质性,将更直接、全面揭示异质性的发生机理及调控过程。
免疫共沉淀用于细胞异质性分析在操作上亦需注意以下几点:(1)细胞全蛋白的质量浓度要足够,至少要高于10m g/m l,这样沉淀物洗脱液中的蛋白质才能达到足够的质量浓度以用于电泳。
(2)S D S-P A G E一定要尽量用大块的胶,因为只有经过足够长距离的电泳才能使样品各成分充分分开,以便于进一步分析、提取和测序。
免疫共沉淀法用于细胞异质性的分析,操作简单,结果直接明了,自动化分析快速且排除人为影响因素,分离后胶上蛋白质能有效回收,有利于后续的测序等分析工作。
因此借助于免疫共沉淀法来研究肿瘤异质性的分子机制无疑是一条很好的途径,随着这一研究方法的完善,它将在细胞异质性的研究中发挥重要作用[5]。
2.2 酶与病毒 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶,主要成分是R N A和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身R N A为模板,合成端粒D N A并加到染色体末端,使端粒延长,从延长细胞的寿命甚至使其永生化[6]。
根据目前的研究,端粒酶至少有3个亚单位组成,R N A亚单位T R(t e l o m e r a s e R N A)、端粒酶催化亚单位T E R T (t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e)和T E P1(t e l o m e r a s e-a s s o c i-a t e dp r o t e i n1)。
人类T E R T(h T E R T)是由1132个氨基酸残基组成的多肽,h T E P1可与p123/E s t2p的同源蛋白h T E R T免疫共沉淀,并和端粒酶活性有关[7～9]。
应用免疫共沉淀技术,验证新基因A n g R e m l04和糖皮质激素受体特异延伸因子(G R-E F)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究A n g R e m l04的生理功能奠定基础。
A n g R e m l04是我们在血管紧张素I I(A n g I I)刺激人肾小球系膜细胞(M S C)增生和硬化过程中获得的上调表达新基因,全长1690b p,蛋白相对分子质量为37000,是一个多组织广泛表达的基因,在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均有A n g R e m104m R N A表达[10]。