动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法
利用高效液相色谱法 高效检测动物源性食品中β-内酰胺类抗生素残留
食品睑测FOOD INSPECTION 利用高效液相色谱法高效检测动物 源性食品中(3_内酰胺类抗生素残留■文I刘彦钊张丽丽河南质置工程职业学院p些年来，由于p-内酰胺类抗生素细三、高效液相色谱-化学发光法菌耐药性通过食物链从动物源性食由于其固有的灵敏度和选择性，化学发光检测品向人体的转移，消费者越来越担心畜牧业及水产养殖业中的抗生素滥用情况。
动 物源性食品中p -内酰胺类抗生素的低浓度水平和基质复杂性，使得在测定其残留量时必须使用高度敏感、高特异性的测定方法。
目前，高效液相色谱法（H P L C)联合 其他检测仪器已被广泛用于动物源性食品中卩-内酰胺类抗生素残留的检测分析。
一、高效液相色谱-紫外检测法目前，通过使用二极管阵列检测器(D A D )进行U V检测是与H P L C结合使用的非常流行的技术，但在确定P-内酰胺方面存在一些局限性，例如，由于缺乏生色团而导致灵敏度较低，H P L C-U V甚至 在不使用D A D的情况下也不能完全可靠地进行(3-内酰胺确认。
串联质谱法质谱法是确定食品中是否存在(3 -内 酰胺的首选检测技术。
尽管此检测技术具有很高的选择性，但仍需要先进行色谱分离，以避免共洗脱化合物的离子抑制。
P- 内酰胺首先使用热喷雾通过H P L C-M S测 定，由于|3_内酰胺电离的简便性，目前电 喷雾电离（ESI )是这两种技术之间的首选接口。
尽管P-内酰胺具有羧基，但是由于灵敏度较高，通常使用正离子化。
是抗生素检测中常用的方法。
（3-内酰胺可以通过两种方式参与化学发光反应：增强化学发光发射；用合适的化学发光试剂衍生化。
目前与高效液相色谱联用检测P-内酰胺抗生素的化学发光体系常见的有K M n04、C e(I V)、鲁米诺、R u (bpy ) /+等。
四、高效液相色谱-荧光分析法目前已有使用高效液相色谱法联合荧光检测器测定P-内酰胺的相关报道。
由于P-内酰胺类化合物中缺少荧光团，通常需要衍生化，而衍生化造成处理过程繁琐，所以效率不佳。
动物抗病毒药残留检测方法研究进展
动物抗病毒药残留检测方法研究进展随着现代畜牧业的发展和对动物生产的需求不断增长，动物抗病毒药的使用也越来越广泛。
然而，抗病毒药使用过量会对动物和人体健康造成严重威胁，因此对抗病毒药残留的检测变得愈发重要。
本文将对动物抗病毒药残留检测方法的研究进展进行综述。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法（HPLC）是目前应用最广泛的抗病毒药残留检测技术之一。
它利用高效液相色谱仪对样品中的药物成分进行分离和检测。
HPLC法检测的优点是高灵敏度、高精度、快速、有效。
然而，HPLC法对样品的前处理步骤要求非常严格，对装置的维护和保养也非常重要，否则容易出现误差。
气相色谱法（GC）也是一种常见的抗病毒药残留检测技术。
它利用气相色谱仪对样品中的有机成分进行分离和检测。
GC法的优点是灵敏度高、分辨率高、特异性强。
但是，它对温度、湿度等环境因素的影响较大，操作和维护过程也较为复杂。
三、质谱法（MS）质谱法（MS）是一种高分辨率、高精度的分析技术，可以对样品中的分子进行定量和鉴定。
将MS与色谱法结合起来，可以得到更加准确和可靠的分析结果。
同时，质谱法对样品的前处理步骤要求较低，适用于对样品量较少的检测。
四、免疫学检测法免疫学检测法是指利用抗体与抗原相互作用的原理，对样品中的目标物质进行检测。
免疫学检测法的优点是快速、简便、易于自动化，同时适用于大规模样品的检测。
目前，免疫学检测法已广泛应用于动物抗病毒药残留的检测。
综合来看，动物抗病毒药残留检测的技术越来越成熟，同时各种检测方法各有优缺点，因此在实际应用中要根据具体情况选择合适的检测方法。
在未来，随着科技的不断进步，相信会出现更加灵敏、准确、高效的检测技术。
牛结核病检疫方法研究进展核心探索
牛结核病检疫方法研究进展核心探索牛结核病（bovine tuberculosis，简称TB）是一种由结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道疾病，严重影响了牛类的健康和生产。
牛结核病是一种传染性疾病，同样威胁到人类的健康。
为防止牛结核病的传播，检疫控制非常重要。
传统的结核病检疫方法包括皮内试验、血清学检测和结直肠检测等，但这些方法存在一些局限性。
本文将就现有牛结核病检疫方法的研究进展和核心探索进行综述。
一、传统牛结核病检疫方法1.皮内试验皮内试验是目前牛结核病检疫的一种非常常用的方法，其原理是将结核分枝杆菌弱毒株注射到牛皮下或侧腹部的乳突区域皮下组织中，一定时间后通过皮肤反应或组织反应来检测感染情况。
但是，这种试验的结果会受到很多因素的影响，例如免疫水平和生产状态等因素，导致其存在一定的误差。
2.血清学检测血清学检测也是一种比较常用的检测方法，常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定（RIA）等。
这种方法通过检测血清中特定结核分枝杆菌抗体的存在来诊断结核病。
但是，这种方法容易产生假阳性和假阴性结果，不适合在牛群中使用。
3.结直肠检测结直肠检测是通过检测结直肠内的结核分枝杆菌来判断牛是否感染结核病。
这种方法的优点在于可以在活体牛上进行，同时具有比较高的检测准确性。
但是，这种方法需要复杂的设备和专业技术支持，费用较高，因此不适合在大规模牛群中使用。
1.基于PCR技术的检测方法聚合酶链式反应（PCR）是一种新兴的检测方法，可以在短时间内检测出极少量的DNA 序列。
因此，PCR技术被广泛应用于许多传染性疾病的检测中。
针对牛结核病的检测，研究人员已经开发出了许多基于PCR技术检测结核分枝杆菌的检测方法，如荧光PCR法、实时PCR法和LAMP法等。
这些方法可以在短时间内实现高通量检测，且具有很高的敏感性和特异性，有望成为一种有效的牛结核病检测方法。
近年来，一些新型的免疫技术也逐渐被应用于牛结核病的检测中，如免疫荧光技术（IFT）、免疫磁珠技术（IMT）、磁感应测定技术（MID）和立体免疫层析技术（LFI）等。
牛结核病检测方法及防治要点、是由什么引起的
牛结核病检测方法及防治要点、是由什
么引起的
牛结核病是由什么引起的呢？牛结核病是由分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病。
下面我们了解一下牛结核病检测方法及防治要点。
一、牛结核病诊断要点
在牛群中发生进行性消瘦、咳嗽、顽固性下痢、慢性乳房炎、体表淋巴结慢性肿胀、被毛焦糙粗乱等症状，可初步诊断。
结核病患牛精神萎靡，不愿活动，易疲劳，或出虚汗。
临床主要表现为虚弱，渐进性消瘦。
其病理特征是在组织器官形成结核性肉芽肿（结核结节），继而结节中心发生干酪样坏死或钙化。
二、牛结核病的剖检
(1)肺结核，在肺脏表面有很多粟粒至豌豆大的白色结节，切面呈干酪样坏死并发生钙化，切割时有沙砾感。
有的由于机体抵抗力低、病原菌毒力强，病变部组织溶解，在表面形成糊状，边缘有增生性肉芽肿，严重的可导致空洞。
(2)胸腹膜发生结核时，浆膜密布半透明结核结节，类似于珍珠状，故称为珍珠结核。
无论任何组织器官患结核病灶，共同的特征是形成结核结节或肉芽肿。
三、牛结核病防治要点
1、防治原则
加强饲养管理，定期消毒，定期检疫，必要时免疫接种。
奶牛要每年进行2次包括结核、布氏杆病在内的健康检疫，群体内发现结核病患牛时隔离治疗，严重的要淘汰。
对阴性牛要预防接种。
2、治疗方法
治疗可肌注链霉素，口服异烟肼、对氨基水杨酸和环氨酸等。
注意结核病是一种慢性传染病，病程发展缓慢，治疗也需要漫长的过程。
治疗时除需要药费支付，还要有隔离条件，除非是优良品种考虑隔离治疗外，一般均予淘汰。
畜禽结核病的诊断和防控措施
畜禽结核病的诊断和防控措施畜禽结核病是一种由结核分枝杆菌引起的病症，可感染各种畜禽动物，通过呼吸道、消化道、皮肤等途径传播给人类。
该病具有高度的传染性和致病性，对人畜健康产生严重威胁。
为了及时发现和控制该病的传播，需要加强对畜禽结核病的诊断和防控措施。
畜禽结核病的诊断主要包括临床诊断和实验室诊断两个方面。
临床诊断主要通过观察动物的症状和体征来判断是否患病。
病畜常出现消瘦、食欲不振、咳嗽、腹泻等症状，体温也有可能升高。
实验室诊断主要通过采集动物的血液、组织或体液样本，经过培养、PCR、ELISA等方法进行检测。
PCR技术可以快速检测结核分枝杆菌的存在，ELISA技术可以检测动物体内是否产生了结核抗体。
综合临床诊断和实验室诊断的结果，可以确定动物是否感染了结核分枝杆菌。
1. 引进无结核病源动物：畜禽结核病主要通过密切接触传播，因此引进无结核病源动物可以有效减少病害传播的风险。
在引进动物前，需要对其进行疫情调查和结核检测，确保其无结核菌感染。
2. 隔离和检疫：对于有结核病源动物的场所，需要进行隔离和检疫措施，防止病害传播。
隔离、检疫和治疗病畜是防控结核病的重要环节，可以有效减少病害在群体内的传播。
对于确诊或疑似感染结核病的动物，应尽早进行隔离，并采取适当的药物治疗。
3. 环境消毒：结核分枝杆菌在环境中具有一定的存活能力，对于有结核病源动物的场所，需要及时进行环境消毒。
消毒剂的选择要注意对结核分枝杆菌的杀菌作用，并且要保证消毒剂的浓度和接触时间。
4. 加强免疫措施：针对结核病的疫苗研发较为困难，目前尚无可用的有效疫苗。
加强畜禽的免疫措施，提高其抵抗力，是控制结核病传播的重要手段。
对于特定的动物种类，可以采取定期接种强化抗体的疫苗，提高免疫屏障。
5. 健康监测和疫情报告：加强对畜禽健康监测和疫情报告，发现病害的早期征兆和异常情况，及时采取措施进行防控。
鼓励畜禽养殖场和养殖户主动报告疫情，加强与相关部门的沟通和协作。
牛结核病两种检测方法的比较
技术 是用酶标记抗体 或抗 原 ． 以酶促
反应 指示免 疫 反应 的一类 测定相 应
菌 在 刺 激 机 体 发 生 免 疫 应 答 的 时 ２ １ 原 理 ．
候 ． 发性 变态 反应 也随 之产 生 ． 迟 二
抗 原或抗体 的性质 、 量及其分布部 含
１７ ９ ７年 ．ｅ ｚ Ｌ ｎｉ ｎ研 究 发 现 了 结 位的方法 ． 酶免疫技术具 有标记物稳
者 均 由 Ｔ细胞 介 导 产 生 ． 诱 导 产 核病 的细 胞免 疫与体 液 免疫 分离 的 定性 好 、 放射 性污染 等 优点 ． 但 无 还可 生 免 疫 和变 态 反 应 的 物 质不 同 ． 所 现象 他指 出 ． 细胞 免 疫随病 情加 重 以利 用催 化标 记物进 行 放大 和 自动
性仅 能 表 明在 过 去某一 时 间 曾经 发 义 细胞 免疫 是主 要 的免疫 方式 ． 结 抗 体 水 平 还 达 不 到 可 以检 出 的水
生过 的一 次结 核 菌感染 ．它无法 证 核菌 素试 验是 检测 细胞 免疫 ．血 清 平 ： 或者是 封 闭型结 核 ， 因为机 体 的
以检 测机 体对 结核 菌是 否发 生变 态 而减 弱 ．体液 免疫 随病 情加 重而 增 化分析处理 Ｅ ＩＡＥ ｚｍ －ｉｋ ｄ ＬＳ （ｎｙ ｅ ｌ ｅ ｎ 反应 ． 即可判 断是 否具 有免 疫力 ． 进 强 核菌是 典 型 的胞 内寄生菌 ． 结 尤 Ｉ ｕ ｏｏｂ ｎ ｓａ） ｍｍ ｎ ｓｒｅｔＡ ｓｙ作为一 种新 型
维普资讯
中 国动 物 检 疫
２０ ０ ６年 第 ２ 第 １ ３卷 Ｏ期
一３ ０一
文章 编 号 ：０ ５ ９４ ２０ ）０ ０ ３ — ２ １０ — ４ Ｘ（０ ６ １—０ ０ ０
变性高效液相色谱高通量检测动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌
量 成倍 增 加 ． 同时 由 于两者 增 菌 时 间 （ 门氏菌 １ 沙 ８
２ 、 贺 氏菌 ６ ８ｈ 不 相 同 ． 检验 工作 带 来 一定 ４ｈ 志 ～ ） 给 麻 烦 。曾有研究 报道 ． 选择合 适 的可 同时用作 沙 门氏 菌、 志贺 氏菌 增菌 的 通用增 菌液 ． 提高 实验 室 的工 对
沙 门 氏菌 Ｐ Ｒ Ｄ Ｐ Ｃ检测 的引物序列 ： Ｇ Ｇ Ｃ —Ｈ Ｌ ５一 Ｔ
ＡＡＡ ｒｒ ＴＣＧ Ａ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＡ一３ ５ －ＴＣＡ ． ＂
Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ ＡＧ Ａ方 法 ，在此基 础 上采用 Ｐ Ｒ结合 高效 液相 色谱 Ｃ
基 因扩 增仪 ． 国 Ａ Ｉ 司 生产 ： 性 高效 液相 美 Ｂ 公 变 简 Ｈ Ｌ ， ｒｎｇｎ ｍ ｃ 曹际娟 ， 辽宁省 出入境检验检疫局 ， 究员 ， 研 博士 ， １０ ５ 色谱 （ 称 Ｄ Ｐ Ｃ）美 国 Ｔａｓｅｏ ｉ 公 司生产 。 １６ １ ，
本研 究所 用 标 准菌 株 均 购 自美 国典 型菌 种保 藏 中心 （ Ｔ Ｃ 和 中 国医学微 生物 菌种保 藏管 理 中心 ＡＣ （ ＭＣ Ｃ Ｃ ．其它 菌株 为本实 验室和 其它检验 检疫 局实
１１ 培 养 基 和 试 剂 ．２ ．
详 检 验所用 的增 菌液不 同 ． 即使 是对 同一份 标本也 只能 验 室分离鉴 定获得 的分离株 ， 见表 １ 分别 增菌 、 分别划 线分 离 、 别鉴定 ， 分 使实 验室 的工作
Ｇ ｎｍｉＤ ＡＥ ｔ ｃ ０ ｉ 及 Ｅ ａ『 ｅ ｏ ｃ Ｎ ｘｒ ｔ ｎ ｔ ａｉ ｋ ） ｘ Ｃ Ｔ 等试剂 购 自大连
某公司 三乙胺 乙酰盐 （Ｅ Ａ， Ｔ Ａ 色谱 纯 ） 白 Ｔａ ｓｅ 购 ｒｎｇ —
畜禽结核病的诊断和防控措施
畜禽结核病的诊断和防控措施畜禽结核病是一种由结核杆菌感染引起的动物传染病，主要危害牛、猪、家禽等畜禽。
该病在经济、公共卫生和畜禽养殖等方面都具有重大的影响。
及早诊断并采取有效的防控措施对于控制和预防畜禽结核病的蔓延至关重要。
1. 病理学方法通过对病畜禽器官进行解剖、观察和分析，可以发现结核情况。
肺部出现干酪样坏死灶、淋巴结肿大、黄色浸润等病理变化都可以提示结核病的存在。
2. 细菌学方法通过采集患畜禽的组织样本或分泌物，进行细菌培养和鉴定。
一般采用的培养基有坡里斯金培养基、斯卡普培养基等。
通过细菌培养和鉴定，可以得到结核杆菌的存在和种类。
3. 分子生物学方法分子生物学方法主要是利用PCR技术，对病畜禽的DNA进行扩增和分析，通过检测特定的结核杆菌基因序列，可快速确定结核病的存在。
1. 加强养殖管理要从源头控制，加强畜禽的免疫力和机体抵抗力，提高动物的养殖环境和饲养条件，减少疾病传播的可能性。
并定期对病畜禽进行体检，发现问题及时处理。
2. 隔离和淘汰病畜禽对于已经发现感染结核杆菌的畜禽，应立即进行隔离，防止疾病传播。
对于患有慢性和复发性结核病的畜禽，应及时淘汰，以防止疫情扩散。
3. 加强饲料与水源的管理结核杆菌可以通过食物和饮水进入畜禽体内，应加强对饲料和水源的管理和检测，确保其不受到污染和感染。
4. 实施疫苗接种结核病疫苗是预防和控制结核病的一种重要手段。
应对病畜禽进行疫苗接种，提高其免疫力和抗病能力，降低疾病的发生和传播风险。
5. 加强卫生防护在养殖过程中，应加强卫生和防护措施，保持养殖场的清洁和卫生，减少疫情传播的可能性。
并定期消毒和清洁畜禽舍、设备和工具。
对于畜禽结核病的诊断和防控，需要结合病理学、细菌学和分子生物学等方法进行综合分析和判断。
在防控方面，主要通过加强养殖管理，隔离和淘汰病畜禽，加强饲料和水源的管理，实施疫苗接种，以及加强卫生防护等措施，共同预防和控制畜禽结核病的传播。
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动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法1范围本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱（mPCR-DHPLC）检测方法的技术要求和操作规范。
本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本标准。
3.1 DHPLC：Denaturing high-performance liquid chromatography，变性高效液相色谱。
3.2 dNTP：deoxyribonuclesosde triphosphate，脱氧核苷三磷酸。
3.3 PBS：phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液。
3.4 mPCR：multiplex-polymerase chain reaction，多重聚合酶链式反应。
3.5 TEAA：三乙基铵醋酸盐4 概述人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。
结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。
与MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。
NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。
此外，NTM感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。
采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌多重PCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。
在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模版不同区域扩增出多个目的DNA片段。
DHPLC分析技术是利用液相色谱技术，在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，DNA片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的DNA片段分离。
由紫外或荧光检测被分离的DNA样品。
根据DNA扩增片段长度大小，不同分子量的特异扩增产物在特定位置呈现吸收峰，从而对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌进行快速检测。
5材料与试剂5.1 仪器与耗材。
5.1.1 变性高效液相色谱分析仪。
5.1.2 核酸扩增仪。
5.1.3 II级生物安全柜。
5.1.4 接种棒。
5.1.5 恒温水浴锅（室温至100℃）。
5.1.6 离心机。
5.1.7 微量可调移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。
5.1.8 天平。
5.1.9 PCR光学反应管。
5.2 试剂。
5.2.1 试剂级别：除另有规定，所用化学试剂均为分析纯。
5.2.2 检测用引物：见表1。
表1 分枝杆菌PCR-DHPLC检测扩增引物序列采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物（序列见表1）配制成100μmol/L储存液，置-20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。
5.2.3 0.01 mol/L PBS（pH7.6）：配方见附录A中A.1。
5.2.4 柠檬酸钠缓冲液：配方见附录A中A.2。
5.2.5 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）：配方见附录A中A.3.5.2.6 柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见附录A中A.45.2.7 4% 氢氧化钠溶液：配方见附录A中A.55.2.8Triton X-100。
5.2.9DNA提取液：含100 mmol/L Tris-HCL（pH8.0），0.01% Triton X-100，20μg/μL蛋白酶K。
5.2.10灭菌双蒸水。
5.2.11三氯甲烷。
5.2.12 dNTPs: dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
5.2.13 Taq DNA聚合酶。
5.2.14 DHPLC缓冲液：配方见附录A中A.7。
6 生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB 19489的有关规定。
7 样品采集与前处理7.1 培养物直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量（取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环）菌样，放到1mL 0.01 mol/L pH7.6 PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。
取1 mL菌液样品，15 000×g离心10 min，弃上清，加1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，15 000×g离心10 min；弃上清，收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。
7.2全血、血清用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血。
将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。
抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或O.5 mol/L EDTA。
每6 mL血液加1 mL抗凝剂。
条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。
取1 mL～2 mL全血样品，15 000×g离心10 min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15 000 ×g离心10 min；弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。
血清样品处理方法同7.1。
7.3 痰液动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液。
亦可取咳出的痰块。
在痰液样品中加入2～4倍体积4％氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30 min，间或振荡混匀，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4％氢氧化钠溶液直至液化完全）；15 000×g离心10 min；弃上清，加1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，15 000×g 离心10 min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。
7.4 组织器官采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝、脾、肺等。
取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1：5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液（例，1g 组织样品，加入5 mL缓冲液），充分研磨；加等量4％氢氧化钠溶液，继续研磨5 min～10 min，使组织液化；移入离心管，充分振荡，75℃水浴0.5 h ～1 h；取上清（避免吸取粗渣），15 000×g 离心10 min；弃上清，加等量0.01 mol/L pH 7.6 PBS ，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15 000×g 离心10 min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置-20℃贮存备用。
注：可采用其他经验证有效的样品处理方法。
8 操作方法8.1 核酸提取在上述已完成前处理的样品（沉淀物）中加入50 μL～100 μL DNA提取液，充分振荡混匀， 56℃水浴30 min，98℃～100℃加热10 min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12 000×g离心5 min，取上清，直接用于PCR或贮存于-80℃备用。
注：可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒或其他经验证有效的核酸提取纯化方法。
8.2 mPCR扩增采用50μL反应体系，反应液中含dNTPs 0.2 mmol/L，IS6110、IS1081、MTss127、MBss229上下游引物每条各0.2 μmmol/L，Mg2+ 1.0 mmol/L，1 unit Taq酶，模版DNA 5μL。
扩增循环条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，62℃退火15s，68℃延伸15s,进行40个循环；72℃延伸1min。
8.3 DHPLC分析将装有PCR产物的反应管放置在DHPLC金属板的微孔中。
登录DHPLC分析系统，在非变性分析条件下，采用双链DNA多片段（double-stranded multiple fragment）分析模式,设定方法分析100-430bp 片段；清洗模式采用active；清洗持续时间0.5 min，平衡持续时间0.9 min；流速0.9 mL/min。
温度设定50℃；样品进样量设为5μL~10μL，同一组分析采用同样的进样量。
分析速度为每100bp需2.5 min，每个样品约13.4 min。
分析过程流动相梯度参数由Navigator software分析软件控制设定，具体参数见表2。
8.4 质控对照设置检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。
阳性对照为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株DNA或扩增片段的阳性克隆质粒DNA，阴性对照为非目标致病菌DNA或双蒸水。
表2. DHPLC 流动相参数9 结果及判定9.1 质控标准（参考附录B）9.1.1阴性对照：无特异吸收峰出现。
9.1.2阳性对照：结核分枝杆菌菌株DNA可扩增出结核分枝杆菌复合群IS6110目标基因165bp片段、IS1081目标基因380bp片段及结核分枝杆菌MTss127目标基因213bp片段的产物；牛分枝杆菌菌株DNA 可扩增出结核分枝杆菌复合群IS6110目标基因165bp片段、IS1081目标基因380bp片段及牛分枝杆菌MBss229目标基因241bp片段的产物。
DHPLC分析出现相应片段大小的PCR产物吸收峰，且峰吸收值大于2mV。
9.1.3 不符合上述对照质控标准的视为无效。
9.2 检测结果判定9.2.1 阴性：检测样品无典型PCR产物阳性吸收峰出现，可判定为结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌阴性。
9.2.2 结核分枝杆菌复合群阳性：检测样品出现165bp和/或380bp典型的PCR产物阳性吸收峰，且吸收峰值大于2mV时，可判定该样品结果为结核分枝杆菌复合群阳性。
9.2.3 结核分枝杆菌阳性：检测样品出现213bp典型的PCR产物阳性吸收峰，且吸收峰值大于2mV时，可判定该样品结果为结核分枝杆菌阳性。
结核分枝杆菌阳性同时还应出现165bp和/或380bp产物吸收峰，但也可能由于样品模板浓度或具体反应效果等原因不出现，这些情况不影响判定。