DNA提取液配方及步骤
DNA提取液配方及步骤
裂解液配方：100mmol Tris-Hcl(PH8.0);25mmol EDTA(PH 8.0);500mmol NaCl;1%SDS母液配制：1.500mmol Tris-Hcl（PH8.0）称取15.1425g Tris，加入150ml 蒸馏水，加入Hcl调PH至8.0，定容至250ml。
2.100mmol EDTA或EDTA-Na2称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2，加入200ml 蒸馏水，调PH至8.0，定容至250ml。
3.5mol NaCl称取29.22g NaCl，加入90ml 蒸馏水，定容至100ml。
4.10% SDS称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。
蛋白酶K配置：10mg/ml蛋白酶K溶液。
称取10mg蛋白酶K粉末，加入1ml蒸馏水溶解。
-20度保存。
配制1000ml裂解液：加入溶液1体积为200ml，加入溶液2体积为250ml，加入溶液3体积为100ml，加入溶液4为100ml。
配制500ml裂解液则相应减半。
步骤：1.在1.5ml离心管中加入0.2ml（200ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴2-4h。
2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴30min。
3.加入0.7ml苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。
4.中号枪头切去头部，抽取上清，重复抽提一次。
5.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。
6.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀，材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min，14000rpm离心5min。
7.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。
8.根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。
方法二：1.在1.5ml离心管中加入0.1ml（100ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，用400ul裂解液冲洗研磨棒，加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴1-2h。
DNA提取步骤及注意点
提取DNA：CTAB法
预先准备：黄枪头、蓝枪头（最好剪去头部），小研钵，2ml离心管，液氮
药品：CTAB、β-巯基乙醇、RNA消化酶、冰冻酒精、NaAc
1 取叶片于研磨中，在磨好的样品中加入1-2ml CTAB，20-40ul的
β-巯基乙醇,等溶化成稀糊状态时倒入2ml离心管。
2 加入1-2ul RNA 消化酶-----可不加
3 放入65℃水浴锅加热30min,每隔五分钟上下颠倒几次
4 离心15min 12000r 温度无要求；
5 取上清夜800-1000ul；加入等体积 24：1的三氯甲烷：异戊醇和
苯酚(未加) 上下颠倒3-5min；离心10min 12000r
6 取上清液800-1000ul；再加入等体积24：1的三氯甲烷溶液，上
下颠倒3-5min；离心10min 12000r
7 取上清液600-800ul；加入1/10上清液体积的 3M NaAc之后上下
颠倒3-5min 一般加入70ul左右的3M NaAc
8 先静置3-5min，后加冰冻酒精，加满为止，摇晃3-5min
9 放在-20℃冰箱过夜（静置12小时）
10弃掉上层液体，加入1ml 的70%酒精，摇晃3-5min，
11离心5min 12000r,去掉上清液，再加1ml的70%酒精，摇晃3-5min，12离心5min 12000r去掉上清液，尽量把离心管内的残留液吸干
13放入超净工作台风干；加入70-100ul的灭菌水。
DNA提取总结
(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入1.5mL离心管中；(2)每管加入600μL SDS DNA提取液（含2%的巯基乙醇），于65℃水浴30min，其间温和混匀几次；(3)取出离心管，加入60μL 5mol/L KAc，立即上下颠倒温柔混匀（5~6次），冰上放置20min；(4)于12,000 rpm离心10min；(5)将上清液（约600μL）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温放置5min；(6)加入600μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）；(7)于12,000 rpm离心15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7倍体积的异丙醇，于-20℃下沉淀10~30min；(9)于10,000 rpm离心5min，弃上清，将沉淀用75%乙醇洗2~3次；(10)挥发干净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
CTAB提取液配方
CTAB法DNA提取液
2%CTAB 2000ml配方
CTAB 40g
Nacl 163.64g
1M/L Tris-Hcl 200ml
0.5M/L EDTA 80ml
----------------- 定容至2000ml
1M/L Tris-Hcl 500ml配方
Tris 60.6g
加400ml水搅拌溶解
冷却后加浓盐酸调PH至8.0
定容至500ml
0.5M/L EDTA 500ml配方
EDTA 93.06g
加NAOH调PH至8.0
定容至500ml
注：1M/L Tris-Hcl和0.5M/L EDTA配方跟你配TPS一样。
2%CTAB配方可以到Takara或者其他生物公司目录上查询。
提取步骤
该法提取叶片DNA和TPS法稍有不同，简略如下：
1.提取液加800ul，当然也可以修改；
2.水浴温度改为650C，30min；
3.加500ml氯仿，上下震荡几下即可。
不过你的材料可能要死命震荡几分钟看看咋样，最好再重新用氯仿抽提一遍;
4.12000r/min离心10min,吸取上清液(比如200ml);
5.加2.5倍体积的无水酒精（比如500ml）；
6.其他步骤就一样啦。
7.如果你想提取更高质量的DNA，可以在倒掉酒精之后，用75%酒精把DNA 再洗几遍。
8.如果以上步骤还不行，那就baidu或者小木虫吧。
酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理
酚氯仿法提取DN蛀要步骤和原理酚氯仿法提取DNA 主要步骤：1.将动物组织放在1.5ml 的离心管中，分别用75% 、50% 酒精和纯水梯度脱酒精。
每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DNA 裂解液（300a）,研磨后再加入300a IDNA裂解液冲洗研磨棒。
3.将研磨好的组织液用移液枪加到 1.5ml 离心管，在管中加10al蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56C,5h）。
4.加入等体积的Tris饱和酚（500 a）,摇匀（10min）。
5.离心：12000R, 7min, 4C。
离心后分成上中下三层，上层为DNA ，中层为蛋白质，下层为有机质。
6.吸取上层液体加入新的离心管。
7.配制Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1 。
8.在含有上清液的离心管中加入Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450 a,摇匀10min。
9.离心：12000R, 7min, 4C。
10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400a 1（氯仿：异戊醇=24:1）。
11.离心：12000R, 7min, 4C。
12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5 倍经过-20 C冷冻的100%的酒精。
-20 C过夜。
13.将样品取出，12000R, 7min, 4C离心。
14.弃上清，留白色沉淀（DNA ），加400卩的75% 的经过-20C冷冻的酒精，反复吹打溶解。
15.重复第14 步骤2 次（用75%酒精洗三次）。
16.提取DNA 完成。
溴氯仿法提取DNA 的原理：用酚抽提细胞DNA 时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。
试剂盒DNA提取详细操作步骤
一、试剂盒打开后需要准备的工作1、ProteinaseK（蛋白酶K）的溶解①取4.5ml双蒸水加入蛋白酶K粉中使其充分溶解②将溶解好的蛋白酶K溶液分装进小离心管，每管100u l〜200ul③将分装好的ProteinaseK放入-20°C冰箱中保存，使用期限为12个月2、组织抑制剂（InhibitorRemovalbfer）的调配加入20ml无水乙醇（absoluteethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩3、洗液（washbuffer）的调配加入80ml无水乙醇（absoluteethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩二、组织DNA提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将采集来的样品剪碎（WO.lcm）洗净保存液。
②加入组织破解液Tissue-lysis200ul蛋白酶K40ul然后放入55C水浴锅内3个小时使其充分消化。
2、DNA提取①在消化好的组织样品中加入结合液bindingbuffer200ul然后放入70°水浴锅中10分钟。
②再加异丙醇lOOul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g—分钟。
③倒掉底液，加500ul组织抑制剂InhibitorRemoval然后离心倒掉底液④加洗液washingbuffer500ul离心（洗液加两次）⑤在70C预热ElutionBuffer，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入ElutionBuffer200ul溶解10分钟离心保留底液放-20C保存。
三、细胞DNA的提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将带有培养基的样品用PBS清洗干净8000rpm/1min离心，倒掉上清②加PBS200ul振荡摇匀使之样品成为单个细胞的悬浊液③加200ulBindingBuffer，40ul蛋白酶K混合均匀放入70C水浴锅内消化10分钟。
2、DNA提取①加异丙醇lOOul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g—分钟。
酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理
酚氯仿法提取DNA主要步骤：1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。
每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DN A裂解液（300μl），研磨后再加入300μl DNA裂解液冲洗研磨棒。
3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。
4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。
5.离心：12000R，7min，4℃。
离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。
6.吸取上层液体加入新的离心管。
7.配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。
8.在含有上清液的离心管中加入Tri s饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10mi n。
9.离心：12000R，7min，4℃。
10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：异戊醇=24:1）。
11.离心：12000R，7min，4℃。
12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。
-20℃过夜。
13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。
14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。
15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。
16.提取DNA完成。
溴氯仿法提取DNA的原理：用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了D Nase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与D NA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
DNA提取总结
(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入 1.5mL 离心管中；(2)每管加入 600μL SDS DNA 提取液（含 2%的巯基乙醇），于 65℃水浴 30min，此间平和混匀几次；(3)拿出离心管，加入 60μL 5mol/L KAc ，立刻上下颠倒温柔混匀（5~6 次），冰上搁置20min；(4)于 12,000 rpm 离心 10min；(5)将上清液（约 600μL ）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温搁置 5min；(6)加入 600μL 酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1）；(7)于 12,000 rpm 离心 15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7 倍体积的异丙醇，于 -20℃下积淀 10~30min；(9)于 10,000 rpm 离心 5min，弃上清，将积淀用75%乙醇洗 2~3 次；(10)挥发洁净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存 ;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
一、实验目的掌握植物总 DNA 的抽提方法和基根源理。
学习依据不一样的植物和实验要求设计和改进植物总 DNA 抽提方法。
二、实验原理往常采纳机械研磨的方法破裂植物的组织和细胞，因为植物细胞匀浆含有多种酶类(特别是氧化酶类)对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强复原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，资料易于破裂，并减少研磨过程中各样酶类的作用。
十二烷基肌酸钠 (sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB) 、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，进而使 DNA 得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除掉细胞碎片和大多半蛋白质。
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裂解液配方：100mmol Tris-Hcl(PH8.0);
25mmol EDTA(PH 8.0);
500mmol NaCl;
1%SDS
母液配制：
1.500mmol Tris-Hcl（PH8.0）
称取15.1425g Tris，加入150ml 蒸馏水，加入Hcl调PH至8.0，定容至250ml。
2.100mmol EDTA或EDTA-Na2
称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2，加入200ml 蒸馏水，调PH至8.0，定容至250ml。
3.5mol NaCl
称取29.22g NaCl，加入90ml 蒸馏水，定容至100ml。
4.10% SDS
称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。
蛋白酶K配置：10mg/ml蛋白酶K溶液。
称取10mg蛋白酶K粉末，加入1ml蒸馏水溶解。
-20度保存。
配制1000ml裂解液：加入溶液1体积为200ml，加入溶液2体积为250ml，加入溶液3体积为100ml，加入溶液4为100ml。
配制500ml裂解液则相应减半。
步骤：
1.在1.5ml离心管中加入0.2ml（200ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴2-4h。
2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴30min。
3.加入0.7ml苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。
4.中号枪头切去头部，抽取上清，重复抽提一次。
5.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。
6.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀，材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min，14000rpm离心5min。
7.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。
8.根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。
方法二：
1.在1.5ml离心管中加入0.1ml（100ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，用400ul裂解液冲洗研磨棒，加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴1-2h。
2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴15min。
3.加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。
4.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。
5.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，14000rpm离心10min。
6.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。
7根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。