Western Blot 实验技术及心得
western blot实验经验总结
western blot实验经验总结1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。
原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。
在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。
Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。
我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。
具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。
揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。
western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。
我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。
效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。
Western-Blotting实验报告
Western Blotting本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
它通常分为两种方法：Western Blotting 方法一: 直接法方法二: 间接法优点： 1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带1. 免特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点： 1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。
一、实验原理Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
免疫印迹实验报告——westerblot
免疫印迹实验报告——westerblotWestern blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
Western Blot个人总结详细版
Western Blot—单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例—中山大学临床检验诊断学硕士—刘记2016/11/141．蛋白制样A．贴壁单层细胞的处理：1）60mm细胞培养皿按200ul/皿，准备RIPA裂解液【6孔板100ul/孔，按底面积换算，用量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证15ul有足够的蛋白上样量】2）使用前将CockTail按1:100加入RIPA，混匀，冰上备用3）收取培养上清后，预冷PBS洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止BCA培养基颜色干扰】4）200ul/皿，加入RIPA裂解液，冰上放置5分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的EP管，冰上放置6）离心，4℃，14000Xg，15min7）冰上操作，收上清至新标记好的EP管，冰上放置B．BCA测定蛋白浓度：按照碧云天BCA试剂盒说明书操作即可1）收取蛋白样品稀释10-20倍测浓度2）蛋白标准品在公用-20℃冰箱2层C．蛋白浓度调整：1）根据BCA蛋白浓度测定结果，按15ul上样体积【15-20ul】，40ug总上样量【30-100ug】，等体积，等蛋白量上样调整浓度至一致2）加入5XSDS蛋白上样缓冲液3ul，剩余12ul由上样蛋白和PBS补足3）按照计算好的每个15ul总体积需要加入的蛋白体积，PBS体积，5XSDS蛋白上样缓冲液体积，按6个15ul即90ul总体积，用量各X6配总体系【0.5mlEP管】，煮沸5min后再分装到每个小的EP管4）用0.5mlEP管配总体系，煮沸5min【使用0.5mlEP管，煮沸时不易进水】5）分装至0.2mlEP管【不要用0.2ml的EP管煮沸，易进水，改变总体积】，-80℃保存备用2．SDS-PAGEA．配胶【以1.0mm厚度mini胶为例】1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶2）选用新配置AP，4℃保存3）将玻璃板洗洁精洗涤干净，自来水冲洗干净，烘箱烘干备用；固定架上的软垫洗涤干净；梳子洗涤干净，烘干备用4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分5）按照每块mini胶5ml用量配置分离胶，3ml用量配置浓缩胶6）加入TEMED后，迅速将分离胶倒入15ml离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接近上缘，最后用1ml加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘【此步骤速度要快，防止凝固，导致分离胶上缘不平】7）尽快用1ml加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问题是AP失效9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸干10）按照配方配置浓缩胶，加入TEMED后，用1ml加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置30min【跟室温和AP活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】12）通过观察配浓缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4℃保存过久易出现裂胶】B．蛋白上样1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满1X的SDS电泳缓冲液2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或粘合】3）蛋白上样，mini胶每孔上样蛋白体积最好15ul，最多不超过20ul，否则容易出现蛋白样品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现β-actin的相连成线，上样预染蛋白marker，并记录蛋白样本次序，记住靠近marker的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋白样本两侧各加一个泳道的蛋白marker，向内压】C．电泳1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极2）打开电源开关，调整电压80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳3）2h左右，观察溴酚蓝位置，待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时，终止电泳，关掉电源，拔下电极，盖子3．转膜-半干转法1）预先配好1L干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液3）用绿色塑料小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶；在电泳缓冲液里小心撬开分离胶，用撬板拖入转膜液内4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸，NC膜，分离胶，滤纸，每放入一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下NC膜后即可用刀片在一角切除标记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶动5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压15V，40min，转膜4．封闭1）转模后，用镊子小心将NC膜取出2）在桌面保鲜膜上加少量TBST，按照预知的目的蛋白分子量KD大小，参照预染marker位置，用刀片切下NC膜，至少多切上下各1个marker位点3）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次4）用5%脱脂奶粉（TBST配置），在抗体孵育盒内，每个格子加入5ml，放入剪切好的NC膜5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时5．孵一抗1）回收封闭液，4℃保存，一周可反复用三次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或者用TBST配置5%BSA作为一抗稀释液】4）每格加入5ml一抗稀释液‘5）摇床，最小转速，4℃孵育过夜6．孵二抗1）回收一抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次，不少于6个月2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用封闭液5%脱脂奶粉（TBST配置）稀释二抗4）每格加入5ml二抗稀释液‘5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时7．化学发光1）回收二抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）1:1配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜1ml量配置4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml加样枪，枪头，发光工作液5）在化学发光仪上曝光拍照8．配置溶液1）10%SDS—用于配胶，常温保存2）AP—新鲜配置，4℃保存3）20%TWEEN—配置TBST需要使用4）转膜缓冲液—按照配方配置2X储存液，用前单蒸水稀释至1X5）电泳缓冲液—公用5X储存液，用前单蒸水稀释至1X，或者按配方自己配置6）TBS—商品化粉末溶解即可7）TBST—TBS和20%TWEEN配置8）配胶所需其他几种成分（30%丙烯酰胺，0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8，TEMED），5XSDS loading buffer，TBS粉末，可以购买商品化产品9．注意事项小结1）电泳缓冲液可配置2X或5X，使用之前用单蒸水稀释至1X，最好不要用PBS稀释，影响组分及导电性2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置2X，用前单蒸水稀释至1X，干转15V恒压时初始电流应在800-900mA才正常；若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途，湿转用转膜液，15V恒压转膜，初始电流300mA左右，不适合干转3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔4）资料：转膜用NC膜不分正反面，注意孔径选择：0.45μm-大于20KD，0.22μm-小于20KD；自己实验证明统一选用0.45μm可以做出结果5）丽春红染色主要目的是NC膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目的蛋白位点的NC膜条带，剪下的NC膜用TBST洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封闭；丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于TBST中配置5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于2h7）一抗用一抗专用稀释液或者TBST配置5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质），4℃慢摇至少孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可4℃孵育过夜或两天，不影响效果8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于2小时9）每次更换孵育液前用TBST进行洗膜，10min/次，洗涤2次，快摇10）剪切好的膜放在抗体孵育盒内，进行封闭，孵一抗，孵二抗及洗膜过程中，不用拿出膜，可直接倾倒液体11）加发光液前，将NC膜从TBST洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸巾，防止蛋白脱落。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
Western blot学习心得
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四蛋白质电泳
• 板子固定于电泳架→板子间加电泳缓冲液→上样→将板子放入 电泳槽中→倒入电泳缓冲液→加盖、插电源 • 1、玻璃板固定要注意小玻璃板向内，大玻璃板向外。 • 2、上样前一定要先加电泳液，将板子处在电泳环境中，起码没 过小玻璃板。电泳槽中按板子数量将电泳液加至2G刻度或4G刻 度。 • 3、将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样太快可使样 品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。 • 4、蛋白上样量一般20-50μg，按浓度计算上样体积，体积一般 不超过20μl。 • 5、样品两边要加Maker，以便于转膜时有清洗的界线。Maker 两边分别加2个孔的上样缓冲液，可减轻边缘效应。 • 6、电泳电压调至100V，电泳1小时。此为经验值，电压小，跑 的慢。观察溴酚蓝刚跑出可终止。
二蛋白质定量
• BCA蛋白质定量盒。按说明说操作。省略
三洗板子、灌胶
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论述学习western blotting技术心得
论述学习western blotting技术心得Westernblotting，也叫做蛋白免疫印迹（immunoblotting），是一种用于检测蛋白质的有效技术。
它有助于研究蛋白的表达、结构及功能的变化。
Western blotting在医学检测、分子生物学研究、病毒分析等领域都有广泛应用。
Western blotting技术主要由几个步骤组成，包括电泳、转印、洗涤、去背景、免疫检测和发光检测等步骤。
电泳能够将蛋白质分离出来，以便以后的检测。
转印将分离出的蛋白质转移到膜上，以便进行后续操作。
然后，经过洗涤这一步，膜上的蛋白质能够实现更好的排列。
随后，进行去背景操作，以减少接下来的免疫检测的干扰。
在免疫检测步骤中，一般使用抗体，对膜上的蛋白质进行特异性结合。
最后，发光检测能够有效检测出特异性结合的抗体，从而获得结果。
在实际操作Western blotting技术时，我深刻感受到，这项技术需要严格控制实验条件，以保证数据的准确性和可靠性。
首先，正确掌握样品稀释量是获得有效数据的关键，过低或过高的比例会造成失真，影响检测结果的准确性。
另外，实验步骤的执行需要严格的时间控制。
如果时间太短，则可能导致结果的不准确；如果时间太长，可能会将蛋白质破坏，也会影响结果的准确性。
此外，在每一步，如转印、洗涤过程中，都需要对操作温度进行精确控制，以确保操作的准确性。
最后，在发光检测步骤时，还需要调整扫描仪参数，以保证数据的准确性。
通过实际操作Western blotting技术，我发现，这项技术具有很高的可行性和准确性，能够有效检测和定量分析蛋白质的表达水平和表达变化。
此外，Western blotting技术操作简单，无需复杂的设备和技术，是一项低成本、高效的检测技术。
通过本次操作，我明白了Western blotting技术的重要性，它能够帮助我们有效获取蛋白质的表达信息。
虽然我们在实验操作时需要更多的耐心和技巧，但正是这种精细的技术，才能够帮助我们研究蛋白质的结构和功能。