菠菜铁氧还蛋白的简易分离方法
菠菜中铁含量的测定
菠菜中铁含量的测定
菠菜中的铁含量可以通过一系列实验和测试来测定。
下面是一种常用的方法：
1.准备样本：从新鲜菠菜中取出一定量的样品，清洗并将其晾干。
2.样品处理：将干燥的菠菜样品研磨成细粉，确保样品均匀。
3.酸消解：将样品加入适量的浓硝酸和高锰酸钾混合液中，然
后在热板上加热消解，直到样品完全溶解。
消解过程中要注意安全操作，避免酸液溅洒。
4.冷却与过滤：将消解液冷却后，使用滤纸或滤膜过滤，去除
残留的固体颗粒。
5.原子吸收光谱法测定：将过滤后的溶液转移到原子吸收光谱
仪中进行测定。
该方法利用原子吸收光谱仪对样品中的铁进行测量，通过测得的吸光度计算出菠菜中的铁含量。
该方法需要使用一些实验室设备和仪器，如热板、滤纸、滤膜和原子吸收光谱仪等。
同时，在进行实验时应该注意安全操作，避免接触有害化学物质和尽量减少样品处理过程中的污染。
菠菜色素的提取和分离实验报告
菠菜色素的提取和分离实验报告菠菜色素提取实验报告菠菜中色素的提取和色素分离绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg))，差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。
它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用的绿色色素，可用于糕点、饮料水等中，添加于胶姆糖中还可消除口臭。
植物中a的含量通常是b的3倍。
尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于石油醚等一些非极性溶剂。
胡萝卜素(C40H56)是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体α—，β—,和γ—胡萝卜素，其中β—异构体含量最多，也最重要。
生长期较长的绿色植物中，异构体中β—的含量多达90,。
β—具有维生素A的生理活性，其结构是两分子维生素A在链端失去两分子水结合而成。
生物体内，β—体受酶催化氧化即形成维生素A。
目前，β—体可作为维生素A使用，也可作为食品工业的色素，β一胡萝卜素还有防癌功能。
叶黄素(C40H56O2)是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。
在绿叶中通常是胡萝卜素的两倍。
较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于色素的提取与分离就显得很重要了(本实验就提取和分离做了相关的研究。
1 实验部分1.1 仪器与试剂仪器:研钵、分液漏斗、显微载玻片、毛细管、层析柱(20×10 cm)、UV-240 紫外分光光度计试剂:石油醚、乙醇(95%)、菠菜叶、丙酮(化学纯)、乙酸乙酯(化学纯)、无水硫酸钠、硅胶G、中性氧化铝(150目,160目)1.2 提取与分离1.2.1 浸泡法提取色素在研钵中放入20 g新鲜的菠菜叶，加入20 mL3:2(体积比)石油醚—乙醇混合液，适当研磨(不要研成糊状，否则会给分离造成困难)，用倾析法将提取液转移到分液漏斗中，每次用10ml水洗涤两次,以除去萃取液中的乙醇。
菠菜中铁元素检验的实验探究
菠菜中铁元素检验的实验探究
如何检验菠菜中铁元素?
检验菠菜中的铁元素的实验步骤有：
第一步：准备实验材料。
准备材料有过氧化氢饱和溶液，硫酸铜溶液，硫酸铁溶液，硅石
滴定液，食盐溶液，维生素C溶液。
第二步：用剪刀剪一片新鲜的菠菜，将菠菜舀入100毫升的容器中，加入4毫升食盐溶液，充分搅拌，稍等片刻
第三步：向溶解的菠菜液中加入5毫升过氧化氢饱和溶液，然后搅拌，分析出混溶质
第四步：在用硫酸铜溶液4毫升,硫酸铁溶液4毫升,硅石滴定液4毫升进行滴定，滴10次，加入6毫克维生素C溶液，搅拌均匀，等片刻
第五步：在用硝酸铁检查，若是有深褐色沉淀，说明铁含量较高，反之则是铁含量低
以上就是检验菠菜中铁元素实验步骤，在实验中可以掌握该实验方法，以便于日后用于检
验植物中铁元素含量。
这也使得人们可以更准确地了解植物中铁元素的含量，并知晓实验
方法的精确操作，以求较为准确的实验结果。
菠菜中色素的提取分离和鉴定(有机化学实验)
菠菜中的色素提取、分离及鉴定一、实验目的1.进一步熟悉和掌握薄层色谱的原理及应用2.了解菠菜中主要色素的基本性质，通过菠菜色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法及原理3.掌握用紫外光谱和荧光光谱鉴别菠菜中色素的原理及方法二、菠菜中的色素简介菠菜叶中富含多种色素成分,如叶绿素（绿色）、胡萝卜素（橙黄色）和叶黄素（黄色）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素 a(C 55 H 72O 5N 4Mg) 和叶绿素 b(C 55H 7O 6N 4Mg)，结构见图1。
二者差别仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。
它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。
植物中叶绿素a 的含量通常是b 的3倍。
尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但分子中大的烷基结构使它易溶于丙酮,乙醇,乙醚,石油醚等有机溶剂。
胡萝卜素（ C 40H 56 ）是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即 α-, β - 和γ - 胡萝卜素，其中β - 异构体含量最多，也最重要。
在生物体内，β - 体受酶催化氧化即形成维生素 A 。
目前β - 胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（ C40H56O2 ）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。
与β - 胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
根据这些色素在有机溶剂中的溶解性,可将它们提取出来。
N N NNH 3CCHCH 2RCH 2CH 3CH 3H 3C OCO 2CH 3CH 2CH 2OOCH 3CH 3CH 3CH 3CH 3Mg叶绿素a 和叶绿素b 的结构（叶绿素a ：R=CH 3， 叶绿素b ：R=CHO ）H 3C CH 3RCH 3H 3CH 3CCH 3CH 3CH 3CH 3CH 3β-胡萝卜素和叶黄素的结构（β-胡萝卜素:R =H ， 叶黄素: R = OH ） 菠菜中各色素的理化性质绿色植物中的叶绿体色素在把光能转变为化学能的光和作用中起着重要作用。
检验菠菜中的铁元素
检验菠菜中的铁元素菠菜是一种常见的绿色蔬菜，它富含多种营养物质，其中包括铁元素。
铁是人体必需的微量元素，它在血红蛋白和肌红蛋白中起着重要的作用。
因此，检验菠菜中的铁元素含量对于了解菠菜的营养价值以及补充铁元素的方法非常重要。
菠菜中铁元素的检测方法有多种，常用的方法包括原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。
其中，原子吸收光谱法是一种广泛运用的分析方法，它可以准确测定物质中的金属元素含量。
在进行实验之前，我们需要准备一些实验器材和试剂。
实验器材包括原子吸收光谱仪、加热板、烧杯、量筒、滤纸等。
试剂主要是铁标准溶液和盐酸等。
首先，我们需要准备菠菜样品。
将新鲜菠菜洗净，去除根部和坏叶，然后用水漂洗几遍，以去除表面的杂质。
然后将菠菜切碎，放入搅拌机中搅拌成糊状。
接下来，我们需要将菠菜样品中的铁元素提取出来。
取适量的菠菜样品，加入盐酸，然后在加热板上加热搅拌。
加热过程中，菠菜样品中的铁元素会被盐酸溶解出来，并形成褐色溶液。
加热的时间可以根据实际情况进行调整，通常约为30分钟左右。
提取完成后，我们需要将提取液过滤。
将提取液倒入烧杯中，然后用滤纸将悬浮物过滤掉。
得到的滤液即为我们所需要的样品。
接下来，我们需要使用原子吸收光谱仪来测定样品中铁元素的含量。
将菠菜样品的滤液分别加入原子吸收光谱仪中的样品池中。
然后，将铁标准溶液依次加入原子吸收光谱仪中的标样池中，以构建标准曲线。
在测定菠菜样品中铁元素含量之前，需要先进行仪器的校准。
将菠菜样品的滤液加入样品池中后，我们需要通过仪器中的控制面板进行参数设置，如波长、光程等。
然后，根据仪器的操作说明，启动原子吸收光谱仪的程序进行测量。
测量完成后，原子吸收光谱仪会根据所选的波长和光程计算出菠菜样品中铁元素的含量。
通过与标准曲线的比对，我们可以得出菠菜样品中铁元素的浓度。
总结一下，检验菠菜中的铁元素含量可以通过原子吸收光谱法来进行。
这种方法准确可靠，并且广泛应用于实际分析中。
菠菜色素的提取和分离
菠菜色素的提取和分离精化2班201024102237陈翠婷摘要：用抽滤和浸泡法从菠菜叶中提取了色素,使用薄层色谱、柱色谱对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行了分离.薄层层析时使用了石油醚-乙酸乙酯=3:2展开剂，洗脱剂的选择是菠菜色素分离的优化条件。
关键词：菠菜色素、色素分离、胡萝卜素、薄层色谱、柱层色谱、叶绿素、叶黄素、洗脱剂、石油醚、抽滤菠菜含有大量的植物粗纤维、维生素C、钙铁等，还含有大量的胡萝卜素、叶绿素、叶黄素等营养色素。
叶绿素是植物进行光合作用所必须的催化剂，也是使用的绿色色素，可用于糕点、饮料水中，添加于胶姆糖中还可以消除口臭。
胡萝卜素的三种异构中β-异构体具有维生素A的生理活性，可代替维生素A使用，也可以作为食品工业中的色素使用，最新研究报道，β-胡萝卜素还有防癌功能。
叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，在光合作用中能起收集光能的作用。
由此可见，叶绿素等天然色素有广泛的用途，对于色素的提取与分类就显得很重要了。
一、实验目的1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2、了解柱层析和薄层色谱分离的基本原理，掌握柱层析和薄层色谱分离的操作技术。
3、初步掌握铺板和湿法装柱及计标比移值R f。
二、实验原理1、绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。
叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即 -胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。
叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。
与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
菠菜的提取与分离
题目：菠菜色素的提取与分离姓名: 王祖喜学号：20101105977学院：生命科学与技术学院专业：生物技术年级：2010级班级：1班指导老师：张永明时间：2013年5月20日菠菜色素的提取与分离内蒙古师范大学生命科学与技术学院2010级生物技术1班王祖喜指导教师张永明摘要:本实验用研钵和体积比为 7:3 石油醚-乙醇提取色素, 使用硅胶柱层析法对叶绿素、胡萝卜素和叶黄素进行分离。
实验结果表明，所提取的结果与实际结果极为接近。
关键字:色素；石油醚-乙醇；硅胶柱层析法菠菜叶中含有叶绿素、胡萝卜素、和叶黄素等多种天然色素. 叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂, 也是食用的绿色色素, 可用于糕点、饮料水等中, 添加于胶姆糖中还可消除口臭. 胡萝卜素的三种异构体中B-异构体具有维生素A 的生理活性, 可代替维生素A 使用, 也可作为食品工业中的色素使用, 最新研究报道, B-胡萝卜素还有防癌功能. 叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物, 在光合作用中能起收集光能的作用. 由此可见, 叶绿素等天然色素有广泛的用途, 对于色素的提取与分离就显得很重要了[1]. 本文采用硅胶柱层析的方法分离色素。
1 实验原理绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55 H72O5N4Mg) 和叶绿素 b(C 55H7０O6N4Mg) ，其差别仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。
它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。
植物中叶绿素 a 的含量通常是 b 的 3 倍。
尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（ C40H56 ）是具有长链结构的共轭多烯。
它有三种异构体，即 a-, β - 和γ - 胡萝卜素，其中β - 异构体含量最多，也最重要。
在生物体内，β - 体受酶催化氧化即形成维生素 A 。
sevage法除蛋白的步骤
sevage法除蛋白的步骤Sevage 法呀，那可是在生物化学领域中挺常用的一种除蛋白的方法呢！咱就来好好聊聊这个。
首先呢，得把咱要处理的样本准备好呀，这就好比要烹饪一道美味佳肴，得先有新鲜的食材不是。
然后就是关键的步骤啦，把样本和Sevage 试剂混合起来。
这就像是一场特别的舞蹈，样本和试剂要配合得恰到好处才行。
接下来呀，就得好好地摇晃或者搅拌它们，让它们充分接触、反应。
你想想，就像两个好朋友见面，得好好聊聊，互相了解一下呀。
经过一段时间的反应后，就会看到一些奇妙的现象啦。
那些蛋白呀，就会被逐渐分离出来，就好像是从大部队中被揪出来的“捣蛋鬼”。
然后呢，把混合物静置一会儿，让它们自己安安静静地待着。
这时候，你就会发现，蛋白乖乖地沉淀在底部或者浮在上面了，这多神奇呀！就像是魔法一样，把蛋白给变出来了。
再接着，小心地把上面或者下面的部分分离出来，这可得仔细着点，别把好不容易分离出来的蛋白又给弄回去啦。
最后呀，得到的就是去除了蛋白的纯净样本啦，是不是感觉很有成就感呢！你说这 Sevage 法是不是很有意思呀？就像一个巧妙的魔术，能把蛋白变走。
但可别小瞧了这每一步哦，一步没做好，可能效果就大打折扣啦。
就像走路一样，一步一个脚印，稳稳当当的才能走到目的地。
在实际操作中，可得注意试剂的比例呀，多了少了可能都不行。
这就跟做菜放盐一样，放多了太咸，放少了没味道。
还有呀，搅拌的力度和时间也得把握好，不能太轻也不能太重，时间不能太长也不能太短。
总之呢，Sevage 法除蛋白虽然听起来有点复杂，但只要咱认真对待，每一步都用心去做，肯定能把蛋白除得干干净净的！让我们的实验顺顺利利的，得出准确可靠的结果呀！大家加油哦！。
铁氧还蛋白_NADP还原酶参与的循环电子传递_叶济宇
后 伴 随 电子 传 递 形 成跨 膜 质 子 梯 度 此 时可 以 看到 延迟 发 光 的 上 升
,
,
其 中以
.
加
N A I〕 P
。
构成 的 电子传递 活力 最大
同样 表 明 了 肝 素 对
,
。
当此反 应 系统 中加入 肝 素后
。
,
延迟 发 光
的上 升大部 分 消失
2 2
FN R
的抑 制作 用
肝素 对 循 环 电 子 传 递 的 影 响
质 体 醒 还 原 酶 ( F Q R ) 将 电 子 传 递 到 质 体 醒 〔` 递[ ’,
5」
。
,
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(3 ) 通 过 F N R 的催 化 构 成 循 环 电子 传
,
在研 究
FN R
的 性 质 时 曾发 现
,
,
在 F N R 的 纯化 过程 中
,
它 总 是 结 合着 一 部 分 细
。 。
r
A 〕P 构 成 非 循 环 电 子 传 递 I
,
,
也 可 以将
e 电子 交给 氧 构 成 假 循 环 电子 传 递 ( M e h l
反应 )
, ,
,
或 将 电 子 传 回 电子 传 递 链 构 成 循 环 电 子 它 们 也可 以 从 P S I 还
。
传递 如 果 在 反 应 系 统 中加 人 人 工 电 子 受 体 如 M V 或 铁 氰 化 钾
.
u
c o n ta n
,
r e 50 m M T i d r t ra e a r e 。 即r t a t s
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菠菜铁实验报告
实验目的：1. 了解菠菜中铁的含量。
2. 掌握使用铁氰化钾检测食物中铁含量的方法。
3. 通过实验验证菠菜中铁的含量是否达到人体所需的水平。
实验原理：铁是人体必需的微量元素，参与血红蛋白的合成，对于维持正常的生理功能至关重要。
铁氰化钾是一种常用的试剂，可以与食物中的铁离子反应，生成深蓝色的沉淀，从而检测食物中铁的含量。
实验材料：1. 新鲜菠菜2. 研钵3. 研杵4. 烧杯5. 铁氰化钾溶液6. 滴管7. 电子秤8. 水浴锅9. 实验记录表实验步骤：1. 样品准备：- 使用电子秤称取一定量的新鲜菠菜，记录重量。
- 将菠菜放入研钵中，用研杵充分研磨成浆状。
2. 提取铁离子：- 将研磨好的菠菜浆倒入烧杯中。
- 加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将烧杯放入水浴锅中，加热至沸腾，保持沸腾状态5分钟，以充分提取菠菜中的铁离子。
3. 检测铁含量：- 将提取好的菠菜溶液冷却至室温。
- 使用滴管取少量铁氰化钾溶液，滴加到菠菜溶液中。
- 观察溶液颜色变化，记录结果。
4. 结果分析：- 根据溶液颜色的深浅，与标准比色卡进行比对，确定菠菜中铁的含量。
实验结果：通过实验，我们得到了菠菜中铁的含量为2.5mg/100g。
实验讨论：1. 菠菜中铁的含量：实验结果显示，菠菜中铁的含量较高，每100克菠菜中含有2.5毫克的铁。
这表明菠菜是一种富含铁的食物，适合缺铁性贫血患者食用。
2. 铁氰化钾检测方法的准确性：铁氰化钾检测铁含量的方法操作简单，结果直观，是一种常用的检测方法。
然而，该方法也存在一定的局限性，如对样品的制备要求较高，容易受到其他金属离子的干扰。
3. 实验误差分析：在实验过程中，可能存在以下误差：- 样品制备过程中，菠菜研磨不充分，导致铁离子提取不完全。
- 水浴加热过程中，溶液温度控制不准确，影响铁离子的提取效果。
- 铁氰化钾溶液滴加量不准确，导致检测结果偏差。
实验结论：本次实验通过使用铁氰化钾检测菠菜中铁的含量，结果表明菠菜是一种富含铁的食物，适合缺铁性贫血患者食用。
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tion of HCN during pregermination periods in many seed species.Physiol Plant,1991,83:27～338 Esashi Y,Matsuyama S,Ashino H et al.β2G lucosidase activities and HCN liberation in unimbibed and imbibed seeds,and the in2 duction of cocklebur seed germination by cyanogenic glycosides.Physiol Plant,1991,83:34～409 Tanaka O,Cleland CF,Ben2Tal Y.Effect of ferricyanide,ferro2 cyanide and KCN on growth and flowering in the short2day plant L em na paucicostata6746.Plant Cell Physiol,1983,24:705～71110 Siefert F,Kwiatkowski J,Sarkar S et al.Changes in endoge2nous cyanide and12aminocyclopropane212carboxylic acid levels during the hypersensitive response of tobacco mosaic virus2infect2 ed tobacco leaves.Plant Grow th Regul,1995,17:109～113 11 Chivasa S,Carr J P.Cyanide restores N gene2mediated resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco expressing salicylic acid hydroxylase.Plant Cell,1998,10:1489～149812 Bradford M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein2 dye binding.A nal Biochem,1976,72:248～25413 Siegel LM.A direct microdetermination for sulphide.A nal Biochem,1965,11:126～132收稿 2000203221 修定 2000206226 1 国家自然科学重点基金(编号:39730040)和中国科学院生物科学与技术研究特别支持费资助课题(编号STZ9822210)。
菠菜铁氧还蛋白的简易分离方法1邓 勇 王宏炜 叶济宇(中国科学院上海植物生理研究所,上海200032)A Simply Method of Isolating Ferredoxin from SpinachDEN G Y ong,WAN G Hong2Wei,YE Ji2Yu(S hanghai Institute of Plant Physiology,The Chinese Academy of Sciences,S hang2 hai200032) 提要 用DEAE纤维素(DE252)从菠菜叶片的抽提液中吸附蛋白,再以NaCl分级洗脱得到含铁氧还蛋白(Fd)的分部。
此Fd制剂具有特征性的Fd氧化还原吸收光谱和催化离体叶绿体光还原NADP的活性。
关键词 菠菜 铁氧还蛋白(Fd) DEAE纤维素 分离方法 铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)是普遍存在于植物体内的一种低分子量的蛋白(M r为11000)。
它参与碳、氮同化和硝酸盐还原等诸多生理活动。
在光合作用电子传递链上,Fd更是联系各种电子传递途径的枢纽。
许多离体实验都要用到它。
光合型的Fd常从菠菜叶片中分离,但传统的分离方法需耗用大量丙酮[1,4],不仅成本高,也给操作带来不便。
我们摸索了一种屏弃丙酮的分离方法,整个操作过程可在水溶液中进行。
分离得到的Fd制剂具有催化离体叶绿体中NADP光还原的活性,能满足实验需要。
材料与方法 取1kg新鲜菠菜(S pi nacia oleracea)叶片,洗净去除中脉后,放在低温(-20℃)中预冷冻,这样解冻后的细胞容易破裂。
用2L的0.02mol・L-1 Tris2HCl(p H7.6)缓冲液分次将冻融后的叶片充分捣碎,用4层纱布和1层尼龙布过滤,滤液以3000×g离心5min,弃去沉淀,集中上层液。
将40～50g DEAE纤维素(DE252)的干粉(指商品包装)直接倒入上层液,缓慢搅拌使DEAE分散开来,吸水膨胀和静放一段时间后,倾倒去部分上层液,将吸胀后的DEAE转移至层析柱上(直径4 cm,柱长30cm)。
为使DEAE均匀地在柱内沉降,操作时可先在柱内灌满缓冲液,一边缓慢放出柱内溶液,一边灌入吸胀的DEAE,使其均匀沉降下来,但应连续灌注直至完成。
用含0.15mol・L-1NaCl的0.02mol・L-1 Tris2HCl(p H7.6)缓冲液洗柱。
需连续洗脱不能中断,一般需洗脱过夜,约需耗用5L洗脱液。
当流出液的颜色由起始的深黄色变为微黄时,将洗脱液中的NaCl浓度改为0.3mol・L-1。
操作时要注意保持柱内DEAE界面的平整。
此时柱的上部有一棕红色的环带析出,并随洗脱而下移,此为含Fd 的部分。
洗脱流速控制在2ml・min-1,以利分部收集。
如棕红色的Fd部分愈集中,则表明洗脱效果愈佳。
合并Fd较集中的部分,体积约20～30 ml,再经脱盐浓缩后,贮于低温(-20℃)中备用。
脱盐浓缩方法既可采用超滤浓缩,也可以经0.02 mol・L-1Tris2HCl(p H7.6)缓冲液透析后,连同透析袋埋在聚乙二醇24000(PEP)中,待体积缩小3～241植物生理学通讯 第37卷第2期,2001年4月5倍后取出。
Fd 的浓度可按Fd 摩尔消光系数ε420=9.4mmol ・L -1・cm -1计算[1]。
结果与讨论1 Fd 的氧化还原吸收光谱 取0.3ml Fd ,用0.02mol ・L -1Tris 2HCl (p H 7.6)缓冲液将样品稀释10倍,在岛津UV 23000分光光度计上扫描吸收光谱。
可在463nm 处看到Fd ox 的特征吸收峰,此为氧化型Fd 的吸收光谱。
在Fd 样品比色杯中放入一小粒硼氢化钠(强还原剂),再扫描吸收光谱,此时463nm 处吸收峰消失,此为还原型Fd 的吸收光谱(图1),表明样品具有Fd 吸收光谱的典型特征。
此外,也可用离体叶绿体和外加Fd 的反应系统,直接测定463nm 处的光、暗吸收差异,观察显示Fd 的氧化还原动力变化[2]。
图1 Fd 的氧化还原吸收光谱2 需Fd 的离体叶绿体NADP 光还原 将用菠菜叶片制备的离体叶绿体[3],放在含有0.05mol ・L -1Tris 2HCl (p H 7.6)、5mmol ・L -1MgCl 2、10mmol ・L -1NaCl 、0.1mmol ・L -1NADP 的3ml 反应液中,反应液中叶绿体含量为20μg 叶绿素。
分别置于两个石英比色杯中,其中一个比色杯中加入20μl Fd 作为样品,另一为对照。
先在340nm 处比色读OD 值;再把样品杯置于光下定时照光,光源可用白炽灯或卤素灯,并用10cm 厚的玻璃水缸隔热。
每照光半分钟后立即测OD 值变化。
从图2可以看到,含Fd 的一组在340nm 处的光密度值会随着照光的进程而上升,表示有NADP 还原,而不含Fd 的一组,仅有微小上升,这可能是离体叶绿体制剂中残留的内源Fd 引起。
根据光、暗的OD 差值即可算出NADP 的光还原速率。
计算方法如下:NADP 摩尔消光系数(ε)为6.2mmol ・L -1・cm -1。
如果照光1min ,340nm 的OD 差值为0.1,则0.1÷6.2=0.016μmol ・ml -1(NADPH )。
设3ml 反应体系中所加的叶绿素量为20μg ,则0.016μmol ・ml -1×3(总体积3ml )×(1/0.02mg )×(60/1)=144μmol (NADPH )・mg -1(Chl )・h -1。
图2 依赖Fd 的离体叶绿体DNADP 光还原 本文所制备的Fd 为粗制品,其纯度虽不能与商品Fd 相比,但对测定离体叶绿体NADP 光还原实验来说,反而比纯化的Fd 有利,因为在非循环光合电子传递链上,还原的Fd 向NADP 传递电子时,还需有Fd 2NADP 还原酶(FNR )的催化,如果Fd 很纯,则反应系统中还需要再加FNR ,而本文方法分离的Fd 制剂中,恰好残留有FNR 等黄素蛋白,这对NADP 光还原反应的进行是有利的。
与传统的方法相比,本方法的主要特点是省略了耗用大量有机溶剂丙酮的分部步骤,作为原料的菠菜容易得到,DEAE 用后还可以再生利用,因此这是一种省时而省钱的简易的Fd 分离方法。
它可以满足离体叶绿体的NADP 光还原实验需要,而且对于教学实验也有参考意义。
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