生物：3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)-PPT精品文档
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高考生物大一轮复习 3酶的制备及应用课件 中图版选修1
考点二 加酶洗衣粉 1.加酶洗衣粉中的酶：
种类
作用
最适 温度 条件
pH 备注
碱性蛋白酶
催化污渍中 的蛋白质水 解
35℃～50℃
9～11 品种多、
使用广
纤维素酶 作用于纤维织物 上的微纤维，避 免出现发毛、缠 球等现象
50℃～60℃
7～11
淀粉酶
催化淀粉 水解
40℃～ 60℃
8～10
脂肪酶
催化脂 肪(油 渍)水 解
3.固定化酵母细胞并发酵产生酒精： (1)实验注意事项。 ①海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。 ②将溶化好的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母细胞混合，避免高 温杀死酵母细胞。 ③固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓 慢滴加到CaC12溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。
类型一 有关酶应用的实验 【典例1】(2013·浙江高考改编)利用紫甘薯制酒可提高其附加值。 请回答： (1)为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入果胶酶和淀粉酶， 其中果胶酶可来自________等微生物。由于酶在水溶液中不稳定，因 此常将酶固定在某种介质上制成______________________。 (2)果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶分解成____________________。
实例
果胶酶
固定化葡萄糖异 构酶
固定化酵母细胞
2.固定化酶和固定化细胞技术： (1)将酶或细胞固定化的方法。 ①包埋法：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中。 ②化学结合法：将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上。 ③物理吸附法：将酶分子吸附在载体的表面上。 一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采 用包埋法固定化，这是因为体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积 小的酶容易从包埋材料中漏出。 (2)固定化细胞常用的载体材料：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤 维素和聚丙烯酰胺等。
中图版选修一 酶的制备及活力测定 课件(30张)
总结：
综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于 过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应 生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根 据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时， 影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、 酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的 准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定 CAT活性时，应该根据具体组织种类及测量要求 选择适合的测定的方法。
方法比较：
研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度 低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量 的样品测定。其优点是不需要任何特殊的 仪器，适用性比较广泛。 紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、 快速、检测线相对较低得到优点。但是对 于测定底物或产物改变量方面不太准确。
四、实验结果
位
以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单
△A
酶活力=——× D 0.01t
酶的比活力=——×D
0.01Wt △A
式中， △A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃 薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
CAT过氧化氢酶活性测定方法
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反 应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 。
即可求出消耗的H2O2的量。
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数 表示： 酶活(mgH2O2/gFW·min)= 式中 A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）； 1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于 1.7mg H2O2。
高中生物 第三章 酶的制备及活力测 第一节 酶的制备及活力测定自我小测 中图版选修1
第三章酶的制备及活力测第一节酶的制备及活力测定1．根据酶在生物体内存在的部位，可分为胞内酶和胞外酶，下列属于胞外酶的是（）A．呼吸酶B．光合酶C．消化酶D．解旋酶2．酶是由活细胞产生的。
下列关于酶的论述，错误的是（）A．绝大多数酶是蛋白质B．酶的数量因参与化学反应而消耗C．酶活力与pH有关D．酶的催化效率很高3．下列与酶的活力有关的说法，不准确的是（）A．酶的活力是由蛋白质结构决定的，不受外界条件的影响B．酶的活力是指酶催化一定化学反应的能力C．酶的活力受温度、pH等因素的影响D．酶的活力高低与反应物浓度无关4．酶催化的反应速度可用哪一项来表示？（）A．单位时间内反应物的减少量B．单位体积内产物的增加量C．单位时间内产物的增加量D．单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量5．右图表示酶活力与温度的关系。
下列叙述正确的是（）A．当反应温度由t2调到最适温度时，酶活力下降B．当反应温度由t1调到最适温度时，酶活力上升C．酶活力在t2时比t1高，故t2时更适合酶的保存D．酶活力在t1时比t2低，表明t1时酶的空间结构破坏更严重6．从水稻种子中提取酶液时，首先要研磨种子，在此过程中要加入石英砂，其原因是（）A．防止酶失活B．使研磨充分，有利于酶释放C．有利于种子内淀粉酶的大量合成D．使酶失活7．下列试管中各注入10 mL过氧化氢溶液，实验中产生气泡最多的是（）8．嫩肉粉是以蛋白酶为主要成分的食品添加剂，就酶的作用特点而言，下列使用方法中最佳的是（）A．炒肉的过程中加入B．肉炒熟后起锅前加入C．先用沸水溶解后与肉片混匀，炒熟D．室温下与肉片混匀，放置一段时间，炒熟9．检测淀粉酶的活力可利用分光光度法。
下列关于产物、检测试剂与现象的说法正确的是（）A．麦芽糖与双缩脲试剂反应，生成红色产物B．葡萄糖与班氏试剂反应，生成砖红色产物C．麦芽糖与3,5二硝基水杨酸试剂反应，生成黄褐色产物D．葡萄糖与3,5二硝基水杨酸试剂反应，生成黄褐色产物10．进行酶活力测定时，将提取的酶液离心后，一部分上清液进行了沸水浴加热；4只试管进行了恒温处理；取出试管后进行了钝化处理。
2016_2017学年高中生物第3章第1节酶的制备及活力测定检测(含解析)中图版选修1
第一节酶的制备及活力测定一、酶的存在及提取1．酶是在生物体活细胞中合成的。
其参与反应部位可以在细胞内，也可以在细胞外。
2．在酶的提取过程中，温度、酸碱性等多种环境条件都可能影响酶的空间结构，导致酶变性，甚至丧失活力。
因而提取出的酶首先需要检测酶的活力。
3．酶的活力通常以单位时间内底物的消耗量或者在单位时间内产物的生成量来表示。
在测定单位时间内麦芽糖的生成量来检测淀粉酶的活力的实验中，测麦芽糖的产量可用分光光度法。
二、酶活力的测定方法和原理1．提取酶液：研磨水稻种子时需加石英砂，目的是充分研磨。
制取匀浆并离心后，取上清液，其中一份要在水浴中加热，目的是使酶失活。
2．滴加酶液。
3．恒温处理。
4．钝化处理：酶促反应进行一段时间后要向反应液中加物质的量浓度为0.4 mol/L的NaOH溶液，目的是钝化酶的活性，使反应终止。
5．测定吸光值：测定吸光值时要把反应液与2_mL3,5—二硝基水杨酸试剂混匀，并沸水浴5 min，才能产生麦芽糖产物。
然后分别移入四支比色杯，用分光光度计在波长520 nm 处进行比色。
6．绘制标准曲线。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中一、植物淀粉酶活力的测定原理：淀粉酶将淀粉水解成麦芽糖。
在NaOH和丙三醇存在下，二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在520 nm波长处有最大吸收峰，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
如果在反应系统中加入适当过量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，在酸性条件下，用标准高锰酸钾溶液滴定多余的H2O2，反应如下：5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4―→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4根据消耗的H2O2的量计算出过氧化氢酶的活力。
酶活力用每克鲜重样品1 min内分解H2O2的毫克数表示。
过氧化氢酶活力[mg/(g·min)]＝(A－B)×(V T/V S)×1.7/W×t式中：A 为对照KMnO 4滴定毫升数(mL)；B 为酶反应后KMnO 4滴定毫升数(mL)；V T 为提取酶液总量(mL)，V S 为反应时所用酶液量(mL)，W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；1.7为换算系数，即每消耗1 mL 物质的量浓度为0.1 mol/L 的高锰酸钾溶液，相当于样品中含有1.7 mgH 2O 2。
高二生物苏教版选修1课件：3-1酶的制备和应用PPT课件
每种酶都有一定的最适 pH 范围。例如,果胶酶最适 pH 范围为 3~4。过 酸、过碱都会使酶发生不可逆失活。
探究点一
探究点二
探究点三
探究点四
3.酶的激活剂: 有时加入酶的激活剂可以提高酶活力。例如,NaCl 可以提高果胶酶的 活力。 4.酶的抑制剂: 加入酶的抑制剂后可以降低酶活力,甚至使酶失去活力。例如,Fe3+、 Cu2+、Zn2+等重金属离子对果胶酶有抑制作用。
一
二
三
四
五
三、酶制剂
酶制剂的种类很多,用途非常广泛。例如,α 淀粉酶可以迅速水解淀粉 分子链中的 α 1,4 葡萄糖苷键,可用于面包、馒头等食品加工;蛋白酶能把 蛋白质水解成蛋白胨、多肽和氨基酸等,降低蛋白质的分子量,从而提高其 溶解性、乳化性和起泡性,以改善食品的营养价值;纤维素酶适用于水果和 蔬菜的果桨或果渣的处理,与果胶酶和半纤维素酶具有协同作用,能够破坏 植物细胞壁,促进细胞内有效物质的释放,适用于植物提取物的生产;脂肪酶 是能将脂肪水解为脂肪酸、甘油二脂、甘油单酯和甘油的水解酶类,可应 用于面粉加工、酒类酿造、食品增香、饲料添加剂以及洗涤剂等领域。
一
二
三
四
五
一、酶的性质和酶活力
1.酶的性质 酶是两性电解质,能在电场中移动;酶的水溶液具有亲水胶体的性质,不 能通过半透膜;酶分子易受一些物理因素(如高温、紫外线等)和化学因素 (如酸、碱、有机溶剂等)的作用而变性,从而丧失活力。 2.酶活力 酶活力也称为酶活性,是指酶在催化一定的化学反应时表现出来的能 力,通常用酶促反应的速率,即酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或 产物的生成量来表示,其国际单位为 IU。 温故知新酶的本质和特性是什么? 提示:酶大多数是蛋白质,少数是 RNA;酶具有高效性、特异性、酶的 催化需要适宜的温度和 pH。
苏教版高中生物选修一3.1《酶的制备和应用》教学课件41张PPT
变性 ，从而丧失 活力 。
2．酶活力 (1)酶活力也称为 酶活性 ，是指酶在 催化 一定的化学 反应时表现出来的能力， 通常用 酶促反应的速率 来表示。
(2)酶促反应速率是指酶促反应过程中， 单位时间内 底 物的 减少量 或产物的 生成量 。 3．度量酶活力的国际单为
IU 。
1．酶的数量会因参与化学反应而变化吗？ 【提示】 酶作为催化剂，其数量和性质在
1．探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对污渍洗涤效果
(1)实验准备 ①带有污染物的实验用布的制取：称取一定量的污染物制 成溶液，取等量污染物滴加在相同大小、质地的新布上。
②称取等量的洗衣粉：用天平准确称取等量普通洗衣粉
和加酶洗衣粉。 (2)实验步骤 ①取大烧杯两个，用量筒量取等量水放入其中。 ②分别向两烧杯中加入称量好的两种洗衣粉，然后同时
(2)实验操作流程：温度或pH对果胶酶活力的影响
(3)结果分析： ①根据实验数据绘制出温度和 pH对果胶酶活力(用酶反
应速度表示)影响的曲线图(如图a、b)；不同果胶酶用量
对出汁率影响的曲线图 ( 在浓度和体积相同的条件下， 如图c)；并最终得到果胶酶最适温度、pH以及果胶酶的 最适用量。
②由于初次实验的梯度变量选择目的性不强，选择的范 围有可能出现过高或过低的情况，这可以从画出的曲线中反 映出来，如图所示，实验中可以根据出现的曲线进一步选择 合适的梯度变量。
探究果胶酶活力因素的实验设计
①如何探究温度和pH对果胶酶活力的影响？ ②如何探究果胶酶的用量？ 1．探究温度和pH对果胶酶活力的影响 (1)实验原理：
①当酶处于最适温度或最适pH时，酶的活力最高。
②若温度过高、过酸或过碱，则导致酶变性失活。
③在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶
高中生物同步课件：3.1 酶的制备及活力测定(中图版选修1)
(4)萨姆纳第一次证明了脲酶是蛋白质。(√)
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第三章
酶的制备及应用
二、酶的活力及测定方法 底物的消耗量 1.酶的活力：以单位时间内_______________ 产物的生成量 或者在单位时间内_______________来表示。 2.酶活力的测定 分光光度法 (1)方法：利用______________进行比色。
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第三章
酶的制备及应用
(2)实例 ①植物淀粉酶的制备及活力测定
使酶失活
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第三章
酶的制备及应用
钝化酶的活性使反应终止
3,5-二硝基水杨 酸试剂 黄褐色 520m 煮沸
栏目 导引
第三章
酶的制备及应用
想一想 进行酶活力测定时，出现了“恒温处理”、
“沸水加热”、“钝化处理”，是否矛盾？
活性达到最高；随后，随着温度的继续上升,
酶的活性迅速下降。A点和C点相比，虽然酶 的活性都很低，A点是低温条件，对酶的分子
结构无影响，随着温度的上升，其活性也会
不断上升，而C点是高温条件，当温度过高时, 会破坏酶的分子结构，使酶的活性发生不可 逆的变性。
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学反应，少数在________发挥作用。 细胞外 温度、酸碱性 3.影响因素：_______________等多种环境条
空间结构 件都可能影响酶的__________,导致酶变性， 直至丧失活力。
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第三章
酶的制备及应用
判一判 (1)人体内、参与物质分解的酶都可以在分泌
物中提取。(×)
(2)高温、低温、过酸和过碱等环境条件都能 改变酶的空间结构，导致酶变性失活。(×) (3)新采摘的甜玉米放在沸水中浸泡后，可使 甜味保持的时间长些。(√)
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
感谢您的观看
THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
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一定不会少给的！”耿正说：“倘若如此，我们一定认真履约！”老板听了很高兴，又说：“还有，在我们酒店献艺期间，你们每日上午来酒店 的时间不可以晚于午时初，午饭和晚饭酒店里免费提供，晚上离开酒店的时间通常不会晚于戌时中；如果晚于这个时间，酒店将现送数量不等的 小费。”耿正说：“谢谢，我们一定会在每日的午时初之前来酒店上班！”老板再次依次看过眼前这举止不俗的兄妹三人，非常有礼貌地问： “请问各位贵姓，怎么称呼啊！”耿正说：“免贵姓耿，我叫耿正，妹妹叫耿英，弟弟叫耿直。”老板连声说：“好名字，好名字啊！”耿英说： “请老板放心，我们一定会在贵酒店用心献艺的！”老板更高兴了，挥手招呼周围的伙计们：“你们都过来和这兄妹仨认识一下吧，以后可要多 照应他们啊！”事实上，老板对原先经常来该酒店献艺的几个艺人都不是十分满意，因此并不曾与哪一个艺人签署过任何形式的聘用契约。他们 只是随意来随意走，哪一个先到了就在这里做一次。后到的没有位置了，就转到其他的酒店另行招揽生意去了。至于酬金，虽然给得很够意思， 但也都只是以小费的形式当日交给就是了。此外，酒店里也从来不为他们提供任何饭菜，只不过吩咐伙计们给以茶水照顾和礼貌接待而已。今日 提出来要与耿正兄妹三人签署聘用契约，不过是该老板的突发奇想而已。这个独具慧眼的精明人看出来，这兄妹三人肯定能给自己的酒店带来丰 厚的回报，因此不但想要留住他们，而且还要约束他们没有机会再去其他的酒店展现才华。十天的试用期圆满结束了，耿正兄妹三人组成的拉奏 演艺说唱班取得了空前的好效果，“盛元酒店”的上座率日日增加！来这里吃饭的客人，一帮接着一帮在酒店门口排长队等候。老板对耿正兄妹 三人刮目相看，提出来愿意以每月三十两纹银的高薪，与他们签署长期聘用契约，并慎重地征求耿正的意见，看他们兄妹三人到底愿意与酒店签 署一份多长时间的契约。耿正和耿英商议后认为，在酒店献艺期间除了每日需要自掏腰包吃简单的早餐之外，再没有其他消费了。因此，只要做 满了三个月以后，积攒的银子就足够做一个小本的买卖了。虽然在这个大酒店献艺确实是无本大利，但他们不想长期做这个。于是，耿正郑重地 对老板说：“多谢老板器重，我们想先签署一份三个月的契约！您看如何？”老板有点儿不解地问：“只签三个月？”耿正说：“是，三个月！” 老板想一想，爽快地说：“行，那就先签三个月吧。三个月的契约期满后，咱们再商量续签的事情！”当下，老板就当着耿正兄妹三人的面，亲 自口授，让柜台的账房先生拟定，并誊写了完全相同的两份为期三个月的聘用契约，由他自己和耿正分别签字画押以后，双方各执一份。然后， 他又
实验步骤
2.硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉 末(相当于0. 40饱和度，0℃)，大约在1～2h内加完，置冷室中放置过夜。次 日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉 淀，合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随 搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分 在冰冻离心机中以13 000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀 悬浮于100～150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋 内，放在流动自来水中进行透析1～2天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5% 乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2～3 次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在
3.1 酶的制备及活力测定
辣根过氧化物酶的制备及活力测定
实验目的和要求Leabharlann 1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。 2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。
实验原理
2H 2 O 2 →O 2 +2H 2 O
这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质
类 (hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在
达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。
实验步骤
二、 HRP
1.活力测定：测定k4值的方法操作如下：取2个比色池(带盖，
光程1cm)，按表加入反应物。
对照样品
磷酸盐缓冲液 愈创木酚溶液
反应物 2.90mL 0.05mL 0.01mL
2.91mL 0.05mL 0.0mL
酶液
酶液：将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。
实验结果
1.计算产品的RZ值及k4
2.计算产品的比活力。
思考题
1.盐析法制备辣根过氧化物酶的原理是什么? 2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶的原理是什么? 3.测定辣根过氧化物酶的活力时，要求什么样的pH和 温度?是否需要先测定酶液的蛋白质含量?
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原电势很低，pH6.08时，E ' 0 =-0.2070V，pH为7.71 0 =-0.2787V。 E′
辣根过氧化物酶的活力测定方法
1.RZ值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明 酶的纯度。RZ= A403nm/A275nm ，403nm处的吸收代表血红 素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的 RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL
实验原理
辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40 000 左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色， 透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度 以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室
温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还
细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
实验原理
辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称
HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧
化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离
此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，
经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子 纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根 过氧化物酶。
实验步骤
加好反应物，摇匀，在 470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立即
加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔
30s读数1次，约5min 将所测样品的 A470nm值减去相应时间对照的A470nm值，然后以 A470nm值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟光 吸收的增加，即求出△x/△t ，按公式(8)求出k4值。或不求k4值，而把在 上述条件下，每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP 2.蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质含 量，
冰冻离心机中以4 000r/min离心15min
实验步骤
3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴
中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍 体积预冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰
冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉
淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积) －15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离 心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏 RZ 溶液。 值近于1的酶
2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)
为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连
酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度
有关。 本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。
实验步骤
一、 HRP 1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根 皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉 机中绞碎1～2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌 提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离 心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提 取1次，合并2次滤液，测得总体积。
实验步骤
4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L 硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清 液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心， 洗液与清液合并，分装于透析袋内，用 水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真 空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色 纤维状松软物，HRP RZ 值可