(CH50)测定补体实验
补体检测及应用
1:4
4444 4 4 3
2
0
1:8
4444 4 3 2
1
0
1:16
4444 3 3 2
±
0
1:32
4444
3
2
±
0
0
1:64
4444 2 1 0
0
0
1:128
4210 0 0 0
0
0
1:256
3100 0 0 0
0
0
1:512
0000 0 0 0
0
0
抗原对照
0000 0 0 0
0
0
注:1、2、3、4分别表示补体结合反应强度 ; 0表示全溶血,补体结合试验阴性
（二）试验方法
1.2%-5%绵羊红细胞（SRBC）的配置
2.溶血素：抗绵羊红细胞抗体，是以SRBC免疫 家兔所得的兔抗血清。试验前要进行溶血素的 稀释和滴定。
3.稀释缓冲液:PH7.2-7.4磷酸盐缓冲液 Ca+2、Mg
+2
不同稀释度溶血素的配置
最终稀释度 稀释液(ml) 稀释度
溶血素（ml）
3
0.20
1.30
4
0.25
1.25
5
0.30
1.20
6
0.35
1.15
7
0.40
1.10
8
0.45
1.05
9
0.50
1.00
10
0,00
1.50
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合试验原理:
是根据抗原和抗体反应所形成的复合物吸附并激活 补体的原理所设计的一种血清学反应。
有5种成分参与，分属于3个系统： ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗 体（或抗原） ②补体系统 ③指示系统，即SRBC与相应溶血素。
补体结合试验原理
受检系统
指示系统
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
胞
抗原/抗体
体
溶血素
溶血反应 阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
补体结合试验原理
补体 待检系统
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
补体未消耗
待检系统
指示系统（溶血）
•液体混浊呈浅红色为不溶血，液体透明呈红色为溶血。 •第2、3、4管为对照管应溶血，第5管为SRBC对照不应溶血。 •凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血 者为阳性。
取上述混悬液0.1毫升加pH7.4巴比妥缓冲液 0.5毫升，与标本同置37℃ 30min。
结果判断及意义
将50%溶血标准管与各稀释度试管用肉眼比色， 颜色与标准管相同者即为终点。
血清总补体活性(CH50)测定 临床免疫学
实验六、血清总补体活性(CH50)测定【实验目的】1、掌握总补体活性(CH50)测定的原理2、熟悉实验步骤，影响因素，结果判断标准，结果计算方法。
【实验原理】绵羊红细胞（Ag)与溶血素(Ab)，在新鲜血清补体的作用下，绵羊红细胞可被溶解，出现溶血现象。
溶血程度与血清中补体量正相关，呈S形曲线。
在50%溶血附近，稍微改变补体量，溶血程度变化明显（溶血程度与补体量之间呈明显线性关系），因此以50％溶血率来判定终点较100％更为敏感，所以该试验称为50％溶血试验-CH50（Complement Hemolysis 50%)【实验材料】巴比妥缓冲液、SRBC（Alsever氏液保存）用时加4份DW（pH7.4），溶血素，NS，待测血清（用时1:20稀释），空针，针头，试管，刻度吸管，离心机，721分光光度计（配0.5cm比色皿），37℃水浴箱【实验步骤】1. 制备1:20待测血清：抽静脉血凝固→500-1000rpm离心→分出血清，BB液作1：20稀释2．制备2％SRBC：SRBC用NS洗涤3次→按压积用B.B液配成2%悬液：2ml压积+98mlB.B液，并进行验证（调T为38%~42%）3. 制备50%溶血标准管：2％SRBC 2ml+ DW 8ml配成全溶管，然后取全溶管上清2.5ml + B.B液2.5ml⒋CH50测定：按下表加各试剂→摇匀→37℃水浴30min→离心→测A542nm →计算出每ml血清中补体活性（u)血清总补体溶血活性的测定（2.5ml体系）【实验结果】取各管离心后与50%溶血标准管做初步目视比较，观察溶血程度。
选择与标准管在分光光度计上A542nm光密度值最接近一管的稀释血清量，按下列公式计算CH50活性。
血清总补体活性＝(1/血清量)×血清稀释倍数=66.6u/ml【实验讨论】1．操作注意事项：①待检血清标本应无溶血、无乳糜、无污染。
②缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制，缓冲液若被细菌污染，会导致自发溶血。
补体的测定及应用
正式试验
分类:小量法、微量法，以小量法常用 实验过程:
稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、补体温育
与指示系统共育
结果判度: 对照管: 阴性对照管:溶血 阳性对照管:不溶血 抗体或抗原对照管:完全溶血 待检血清对照管:完全溶血 绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血
2个单位:全溶 ➢ 补体对照管： 1个单位:全溶或略带少许红细
4、补体的性质不稳定，试验前均应进行滴定
待测标本 1、采血并及时分离血清用于检测或－20℃保存备用。 2、试验前，应先将血清56℃加热30min（或60℃3min）以灭活补体。
血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理： 加热灭活时提高12℃ －20℃冻融后离心去沉淀 以3mmol/L盐酸处理 加入少量补体后再行灭活 以白陶土处理 通入CO2 以小白鼠肝粉处理 用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清
补体的活化途径
1、经典途径 以抗原抗体复合物结合C1q启动激活的途径，又称第一途径或传统 途径，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式
2、MBL途径 MBL结合至细菌启动的途径，激活剂是机体的炎症反应急性期时 产生的MBL和C反应蛋白等
3、旁路途径 通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，不依赖特异性抗体的形 成，在感染早期可为机体提供有效的防御。
方法学评价和临床意义
方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比 外，还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温度有关
总补体活性的参考范围为50～100U/ml
CH50增高见于： 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等
CH50降低见于： 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球 肾炎等
➢现 状
影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等， 现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐 渐被遗弃 补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对 新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用
医学检验·检查项目：血清总补体活性(CH50)_课件模板
内容课件模板
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
别名： 血清总补体测定。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
简介：
补体具有溶解靶细胞、促进吞噬、参 与炎症反应等功能，同时补体还在免疫调 节、清除免疫复合物、稳定机体内环境、 参与变态反应及自身免疫性疾病起关键性 作用。总补体活性和单个补体成分含量的 变化，对某些疾病的诊断和疗效观察具有 重要意义。总补体的测定主要反映补体经 传统途径活化的活性程序。临床上常用试 管法测定。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
相关疾病： 炎、类风湿性关节炎肾损害、链球菌感染 后的急性肾小球肾炎。
谢谢！
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
临床意义：
增高见于急性炎症感染、组织损伤、 风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌 炎、心肌梗死、伤寒、多发性关节炎、癌 肿等。 降低见于急性肾小球肾炎、膜增 殖性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮(SLE) 活动期、类风湿关节炎、病毒性肝炎、慢 性肝病、亚急性细菌性心内膜炎、遗传性 血管神经性水肿等。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50）验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
相关检查： 血清补体C6含量、血清补体C1q、血清补 体旁路途径活性、自身免疫性疾病14项。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
相关症状： 低补体血症、关节疼痛、斑疹、疲劳、发 热、血管性水肿。
医学检验·各论：血清总补体活性（CH50） >>>
血清总补体溶血活性(CH50)测定操作说明书
血清总补体溶血活性（CH50）测定操作说明书实验原理利用绵羊细胞与相应抗体（溶血素）结合成的复合物，可激活血清中的补体，导致红细胞溶解，当红细胞和溶血素量一定时，在规定反应的时间内，溶血程度与补体量及活性呈正相关。
在接近50%溶血（CH50）时，二者之间近似直线关系，故以50%溶血作为最敏感的判断终点。
以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50U，可计算出待测血清中总的补体溶血活性，以CH50U/ml表示。
本试验主要反映补体经典活化途径的溶血功能，其结果与补体C1～C9各组成分的量及活性均有关。
1．试剂及配制(1)缓冲生理盐水：①贮存液：●Na2HPO4·12H2O 2.85g●KH2PO4 0.27g（加蒸馏水至100毫升，4℃保存）●NaCl 17.00g②应用液（缓冲液）：5毫升贮存液加95毫升蒸馏水，再加10%硫酸镁0.1毫升。
当日配制。
12小时内使用。
（2）2%绵羊红细胞（From：南京森贝伽生物公司）：无菌采取绵羊血液，于等量Alsever 液中可保存3周。
用前以缓冲液洗3次，并配成2%细胞悬液。
必要时可用吸光光度法或细胞计数法使悬液细胞浓度标准化。
(3)冻干绵羊红细胞溶血素（From：南京森贝伽生物公司）（规格：0.5ml/瓶，0.5ml蒸馏水复溶）：将本品（效价1：4000），用缓冲液作1：2000倍稀释（即0.5ml溶血素加999.5毫升缓冲液）。
(4)待测血清：新鲜血液室温放置30分钟，再4℃放置60分钟，使血块收缩。
4℃离心（3000r/min）10分钟，取上清，-20℃保存。
2.试管法操作步骤（改良Mayer法）（1）致敏羊红细胞：2%绵羊红细胞加等量稀释后的溶血素（1：2000），混匀，置37℃水浴30分钟。
（2）稀释血清：待测血清0.2ml，加缓冲液3.8ml，稀释度为1：20。
（3）配制溶血标准管：2%绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水，混匀，即为全溶血管。
CH50测定(精)
故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶 血敏感的多，这一方法称为补体50％溶血 试验（complement hemolysis 50％ assay），简称为CH50。
以引起50%溶血所需的最小补体量为一个 CH50单位，由此可以计算出待测血清中总 的补体溶血活性，以U/ml表示。
主要试剂与器材
成的致敏红细胞可激活补体，从而导致 SRBC溶解。 当致敏红细胞的浓度一定时，在规定的反
应时间内，溶血程度与补体的活性成正相
关，但不是直线关系，为典型的S形曲线。
在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的 变化不能使溶血程度有显著改变，即溶血 对补体量的变化不敏感。
在半溶血（50％溶血）上下时曲线最陡， 即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度 也会发生较大的改变，也就是说对补体量 的变化非常敏感。
结果判断方法
将各反应管经2500r/min、5min离心后，先用目
测法观察其溶血程度，并与50％溶血标准管比较， 选择与标准管最接近的两管。
再用分光光度计于波长542nm进行比色测定。以
BBS缓冲液为空白对照，校正零点，找出吸光度
与标准管最接近的一管，根据该管的血清用量，
求出总补体溶血活性。
溶血素 2％SRBC pH7.4 巴比妥缓冲液（BBS） 待测血清、蒸馏水 离心机、试管、吸管、恒温水浴箱、分光 光度计、比色杯等
实验步骤
1.稀释待测血清：吸取待测血清0.2ml，加 BBS3.8ml，将血清1：20稀释（已完成）。
2.正式实验
取10只试管，分别编号，按照下表加入各试剂
血清总补体溶血活性测定
概述
补体是存在于血清中的一组不耐热的具有酶活性 的球蛋白。 补体是抗体发挥溶细胞或溶菌作用的补充条件。 在正常情况下，补体含量相对稳定，但在某些疾 病时可发生变化。
血清总补体实验报告
一、实验目的1. 了解血清总补体活性的检测原理和方法。
2. 掌握血清总补体活性（CH50）测定的操作步骤。
3. 通过实验结果，分析血清总补体活性的临床意义。
二、实验原理血清总补体活性（CH50）是指补体在经典途径中活化的程度。
在CH50测定中，补体通过激活C1～C9等补体成分，使红细胞发生溶血。
通过测定溶血程度，可以评估血清总补体活性。
三、实验材料1. 试剂：溶血素、兔抗羊红细胞抗体、生理盐水、5%羊红细胞悬液、2.5%巴比妥缓冲液、CH50标准品。
2. 仪器：恒温水浴箱、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. 标准曲线绘制：将CH50标准品用生理盐水稀释成一系列浓度，分别加入5%羊红细胞悬液，37℃水浴30分钟，测定吸光度（A542nm）。
以CH50浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：取待测血清样本，用生理盐水稀释成一定浓度。
按照标准曲线绘制的方法，测定吸光度（A542nm）。
3. 结果计算：根据标准曲线，计算出待测血清样本的CH50活性。
五、实验结果1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线。
2. 样品测定：待测血清样本的吸光度为X。
3. 结果计算：根据标准曲线，计算出待测血清样本的CH50活性为Y。
六、讨论与分析1. 血清总补体活性（CH50）测定原理及方法：CH50测定是一种常用的检测补体活性的方法，通过测定红细胞溶血程度，评估血清总补体活性。
2. 实验结果分析：本次实验中，待测血清样本的CH50活性为Y。
与正常值50-100UL相比，该样本的CH50活性处于正常范围内。
3. 血清总补体活性（CH50）的临床意义：血清总补体活性（CH50）在临床上具有重要的诊断意义。
增高见于急性炎症感染、组织损伤、风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、心肌梗死、伤寒、多发性关节炎、癌肿等。
降低见于急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮（SLE）活动期、类风湿关节炎、病毒性肝炎、慢性肝病、亚急性细菌性心内膜炎、遗传性血管神经性水肿等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
50%溶血试验(CH50)测定补体实验
溶血CH补体补体实验
标题: 50%溶血试验(CH50)测定补体实验
摘要: 50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。
在50%溶血周围，线段近似一条直线。
因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。
所以用50%溶血作……
关键词:溶血CH补体补体实验
50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。
在50%溶血周围，线段近似一条直线。
因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。
所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：
该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：
假定X=加入的新鲜血清量
y=溶血的百分率，以小数表示
V=斜率
转变成对数，上述公式就变成
材料及器材
1．稀释液（磷酸盐缓冲生理盐水）
NaCl 17g
Na2HPO4 11g
KH2PO4 0.27g
蒸馏水100ml
使用时取此原液50ml，加90ml蒸馏水。
经高压灭菌后即可使用。
加入100%硫酸镁溶液1ml，可增强补体的效能。
2．绵羊红细胞悬液（1×10g/ml）
3．溶血素（2U）
2．被检血清（新鲜豚鼠血清）
3．水平离心机
4．水浴箱
5．721型分光光度计
1．浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制
取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。
取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测O.D值为Di按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。
2．致敏绵羊细胞
取绵羊红细胞悬液（1×102／ml）加等量的溶血素（2U／ｍｌ）。
充分混合。
置37℃水浴中作用30分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×108／ml致敏羊红细胞。
3．补体CH50单位测定
⑴按下表加样：
⑵将各管充分混合。
置37℃水浴中60分钟（摇动1～2次，以免红细胞下沉。
）
⑶从水浴中取出后，立即将各管以2000转／分离心10分钟，将各管上清液分别移于另一试管。
⑷测定各管上清液ＯＤ值（波长＝540ｎｍ）
4．补体ＣＨ50单位的计算
从测定管（第1～5管）及溶血对照管（第６管）的ＯＤ值中减去红细胞对照管（第7管的ＯＤ值。
再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度ＯＤ值（80／800ⅹ该管实际量ⅹ第8管ＯＤ值）。
即为测定管的校正ＯＤ值。
然后计算各测定管的溶血率（ｙ值）
再计算各管的ｙ／（１－ｙ）值。
在双对数坐标纸上，以ｙ／（１─y）值为横坐标，血清用量为纵坐标，得到一条直线。
由于50%溶血（y=0.5）的y/(1─y)值等于1。
即可由横坐标等于1的一点，在直线上求得在纵坐标上相应的截距，此即产生50%溶血的待测血清实际用量。
最后，按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性，以单位/毫升表示之。