蛋白表达系统概述
蛋白表达概述
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源 DNA 插入，因此是表达大片段 DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
选择合适的载体需要考虑的因素： ?目的蛋白的应用 ?目的蛋白已知特定信息 ?克隆策略
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
?对于我们来说，最常用和最需掌握的是 大肠杆菌表达系统
Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在 E.coli 系统表达，就是要根据表达目的在 载体，菌株和培养条件 三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到 ⑴目的基因的表达产量高 ;⑵表达产物稳 定;⑶生物活性高 ;⑷表达产物容易分离纯化。
列举常用的蛋白质表达系统并阐述其基本表达策略
常用的蛋白质表达系统及其基本表达策略1. 介绍蛋白质表达系统是在生物技术领域中广泛应用的重要技术，它可以在大量生产目的蛋白质时提供帮助。
在选择蛋白质表达系统时，科研人员通常需要考虑表达效率、纯度、可溶性和最终产物活性等因素。
在本文中，我们将介绍一些常用的蛋白质表达系统，并阐述它们的基本表达策略。
2. 细菌表达系统细菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，其中大肠杆菌表达系统是应用最为广泛的。
基本表达策略包括将目的基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌的代谢系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择合适的宿主菌株以及优化表达条件等因素。
3. 酵母表达系统酵母表达系统通常采用酿酒酵母或毕赤酵母。
基本表达策略包括将目的基因插入酵母表达载体中，通过酵母的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、选择适当的宿主菌株以及与酵母细胞适应的表达条件等因素。
4. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统常用于大规模生产蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入昆虫表达载体中，通过昆虫细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、适当的宿主昆虫细胞系以及适合昆虫细胞生长的表达条件等因素。
5. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统通常用于生产高度活性的蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入哺乳动物表达载体中，通过哺乳动物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择适合的宿主细胞系以及适合哺乳动物细胞生长的表达条件等因素。
6. 植物细胞表达系统植物细胞表达系统是一种新兴的蛋白质表达系统，常用于农业生物技术和药物开发领域。
基本表达策略包括将目的基因插入植物表达载体中，通过植物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、适合的宿主植物组织以及适合植物细胞生长的表达条件等因素。
结论在选择蛋白质表达系统时，科研人员需要根据目的蛋白质的性质、表达需求以及实验条件等因素综合考虑，并选择最适合的表达系统和基本表达策略。
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点
蛋白质表达系统介绍不同的蛋白质表达系统及其优缺点蛋白质表达是生物学研究中一项重要的技术，它可以通过合成蛋白质来研究其结构和功能。
蛋白质表达系统是实现这一过程的关键工具，主要包括原核表达系统和真核表达系统两种。
本文将对这两种蛋白质表达系统进行介绍，并分析它们的优缺点。
一、原核表达系统原核表达系统是利用原核生物（如大肠杆菌）来表达外源蛋白质的系统。
该系统具有以下特点：1. 高表达水平：大肠杆菌是常用的原核表达宿主，具有高表达水平的优势。
通过利用原核细胞的强大蛋白质合成机器，可以获得高产量的外源蛋白质。
2. 易操作性：原核表达系统相对简单，操作步骤少，易于操作和控制。
不需要复杂的细胞培养条件，可以在常见培养基中进行表达。
3. 快速表达：从启动表达到获得蛋白质通常只需要数小时至数天，速度较快。
这使得原核表达系统在高通量表达和快速实验中具有优势。
然而，原核表达系统也存在一些缺点：1. 外源蛋白质折叠问题：由于原核细胞的机器无法正确折叠某些复杂蛋白质，这可能导致外源蛋白质的不正确折叠和失活。
2. 原核特异性翻译后修饰：原核细胞缺乏一些真核细胞所具有的翻译后修饰机制，这可能影响蛋白质的功能和稳定性。
3. 复杂蛋白质表达困难：对于复杂蛋白质（如膜蛋白），原核表达系统通常无法达到理想的表达水平和正确的折叠结构。
二、真核表达系统真核表达系统主要利用真核生物（如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）来表达外源蛋白质。
真核表达系统具有以下特点：1. 正确的折叠和修饰：真核细胞具有复杂的蛋白质折叠和修饰机制，能够产生正确折叠和修饰的蛋白质。
2. 适用于复杂蛋白质：真核表达系统适用于复杂蛋白质（如膜蛋白）的表达。
真核细胞提供了正确的环境和细胞器，能够较好地表达这类蛋白质。
3. 适用于大规模表达：真核细胞通常可以进行大规模培养和表达，适用于工业化生产。
然而，真核表达系统也存在一些缺点：1. 低表达水平：相对于原核表达系统，真核表达系统的表达水平较低，可能无法满足高产量蛋白质的需求。
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。
蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。
蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
一：原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。
该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。
其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。
二：真核表达系统真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。
因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。
作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。
三：哺乳动物细胞表达系统由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。
表达载体的种类及相应的分离纯化方法作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。
在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。
关于重组人血白蛋白的系统性表述
关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。
随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。
根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。
但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。
用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。
一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。
2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。
3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。
（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。
因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。
珠海恺瑞293细胞蛋白表达系统(3.3版)
客服电话： KOP293瞬时转染蛋白表达系统使用指南（3.3版）1.产品概述本系统适合于HEK-293细胞及其它293细胞的高密度悬浮培养、DNA瞬时转染及蛋白表达。
为确保使用效果，建议用户在使用本系统前详细阅读此使用指南。
此系统所包含的试剂可在本指南末页附录中查找，用户可根据需要自行搭配使用。
2.实验步骤本实验方法根据HEK-293细胞的三角烧瓶悬浮培养经验总结而成，但此蛋白表达系统同时适用于其它悬浮培养方式的293细胞的DNA转染及蛋白表达。
2.1转染前细胞培养1、将HEK-293细胞置于5%的CO2恒温摇床中（使用其它浓度的CO2可能会严重影响细胞培养效果），37℃、120rpm恒温震荡培养（具体转速可根据用户培养箱摇床种类及实际培养情况自行调节）。
传代时，需先做细胞计数和观察细胞活率，尽量选择密度在3-6×106个/毫升的高活率细胞进行传代培养。
过高培养密度的细胞在传代培养后有可能会出现生长速度缓慢、培养密度降低等生长状态的变化，并直接影响重组蛋白表达等后续应用效果。
2、传代培养时建议传代后的细胞密度为0.3×106个/毫升，一般每4天需传代1次（或传代密度为0.6×106个/毫升，每隔3天传代1次）。
本培养液可支撑的最高细胞密度约为1.3×107个/毫升，细胞在达到此密度时存活率一般仍可保持在95%以上。
3、若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。
2.2转染细胞的准备a.在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率。
为确保转染效果，建议使用生长处于指数期（密度约为2~4×106个/毫升）、存活率大于98%的细胞转染；b.细胞无需离心，若细胞密度为2.0×106个/ml时，则可直接转染，若细胞密度>2.0×106个/ml，则需兑入新鲜的KOP293培养液，将细胞密度稀释成2×106个/毫升（客户也可根据自身经验摸索合适的转染密度）；c.摇瓶置于5%的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。
全能型酵母双杂交系统和蛋白表达系统
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酵母双杂交系统和蛋白表达系统
两个待测蛋白存在相互作用，那么融合蛋白上的 DBD 和 AD 就能重新形成有活 性的转录激活因子，从而激活靶基因的表达(图 E)。人为地将靶基因构建为表达 蛋白容易鉴定的基因，称为报告基因（report gene），从而通过检测报告基因 的表达，来筛选这两个待测蛋白是否存在相互作用。 那么这两个融合蛋白是如何构建的？又是如何进入同一个酵母细胞的呢？将 bait 和 prey 两个融合蛋白的基因分别克隆到两个质粒载体中，构建两个重组质 粒，然后将两个重组质粒共同导入酵母细胞中。从而就可以实现在同一个酵母细 胞中同时表达两个融合蛋白。
向是最常用的方向。
优势：- 两个方向的载体：避免自我激活问题的出现；增加发现新的相互作用的机会；
- LexA 系统：降低了假阳性。
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(lexAop)8-ADE2 GAL4
NMY51 酵母采用改良后的，三个独立的报告基因：HIS3, ADE2 和 lacZ，第 一步通过营养缺陷型报告基因（HIS3, ADE2）进行选择性生长筛选，进一步通 过 LacZ 报告基因进行 β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选。
优势：含有三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。
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Roche AG(Switzerland), Cancer Research UK(group of Prof. Steve Jackson), Mount Sinai Hospital(New York), Prionics AG(Switzerland)……
蛋白表达系统分类-概述说明以及解释
蛋白表达系统分类-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白表达系统是一种重要的生物技术工具，被广泛应用于抗原制备、药物研发、基因工程、蛋白质学等领域。
它通过利用生物体内特定的遗传信息和代谢途径，将外源基因转化为蛋白质产物。
蛋白表达系统的分类主要根据基因表达介体的类型，可以分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统。
真核细胞表达系统主要利用哺乳动物细胞或昆虫细胞等真核细胞作为基因表达的宿主，能够产生复杂的蛋白质结构和正确的糖基化修饰。
而原核细胞表达系统则采用细菌或酵母等原核细胞作为基因表达的宿主，具有表达速度快、成本低等优势。
不同类型的蛋白表达系统具有各自的特点和适用领域。
真核细胞表达系统适用于需要复杂蛋白质结构和糖基化修饰的研究和应用，比如抗体制备和疫苗研发。
原核细胞表达系统则更多应用于产生大量重组蛋白质的需求，比如重组酶的制备和蛋白质互作研究。
随着生物技术的不断发展，蛋白表达系统也在不断创新和完善。
例如，通过引入特定的转化子和表达载体，蛋白表达系统的产量和纯度得到了显著提高。
同时，基因工程技术的进步也为蛋白表达系统的开发提供了更多的机会和可能性。
未来，随着对蛋白质功能和结构的深入研究，蛋白表达系统将在生物医学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。
综上所述，蛋白表达系统是一种关键的生物技术工具，通过利用生物体内的遗传信息和代谢途径，转化外源基因为蛋白质产物。
其根据基因表达介体的类型可分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统，各具特点和适用领域。
随着科学技术的进步，蛋白表达系统的发展前景是十分广阔的。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以描述文章的组织和布局，以及每个章节的内容概述。
以下是一个可能的写作示例：在本文中，将对蛋白表达系统进行分类，并深入探讨每个分类的特点、应用领域和发展历程。
本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分首先对蛋白表达系统进行概述，介绍其在生物医学领域的重要性和应用价值。
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第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体
第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞
原核表达载必备的组成
有抗菌素抗性基因 决定载体拷贝数的复制起点 (ori ) 供外源基因插入的多克隆位点
参与控制转录与翻译的必不可少 的原件
另注：外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必 须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下。
核糖体结合位点
启动子 转录终止子
复制 起点
真核生物细胞常用的表达载体
质粒型表达载体 病毒型表达载体
• 腺病毒表达载体 • 逆转录病毒表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
酵母表达系统
昆虫表达体系
可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外
培养细胞中生产蛋白
适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰
糖链有所区别，表达量有限
作为药物宿主细胞未被FDA认可
昆虫表达系统（Bac-N-blu体系）
昆虫表达系统（Bac-to-Bac体系）
哺乳动物细胞表达体系
细菌表达系统
特殊的表达用菌株
BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase
适用pET系列等带T7启动子的载体
M15/SG13009 :
自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体
BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase（硫氧还蛋白还原酶）突变
可进行分泌表达，有天然立体结构
加糖方式与人体蛋白质完全一致
表达量不够高，培养成本较高
动物乳腺组织表达
分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质 至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合 药用蛋白的生产长
用 显 微 注 射 法 产 生 转 基 因 小 鼠
利用 转基 因羊 在乳 汁中 生产 重要 的转 基因 蛋白
蛋白表达体系概述
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
基因载体
质粒 噬菌体 病毒 PCR
重组体
转化
表型筛选
有切口的目的基因
DNA连接酶 转染
电泳法
体外包装
核酸杂交 免疫学方法
带重组体的宿主细胞
目的基因的表达
表达体系的发展
酵母表达体系
优点：可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；
可进行染色体整合型基因表达;
缺点：糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae ）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe ）
thioredoxin reductase/glutathione reductase （硫氧还蛋白还原酶/谷胱甘肽还原酶）双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键
BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达
表达系统的选择
研究基因功能:
大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产:
大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
疫苗:
大肠杆菌, 酵母,
单抗生产:
杂交瘤细胞
工业酶生产:
各种微生物