试验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
显微镜的使用和革兰氏染色法
普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法摘要：微生物的最显著特征就是个体微小，一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。
熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本实验只要是学习并掌握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤，巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
关键词：显微镜油镜革兰氏染色法1前言1.1实验目的1.学习并掌握普通光学显微镜及油镜的原理和使用方法。
2.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征。
3.学习细菌染色的原理和方法。
4.掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
5.巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
1.2 实验原理1.2.1 显微镜的使用在普通显微镜（图1）通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物研究最为重要，与其它物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和物镜间加滴镜油（通常用香柏油），这主要有以下两方面的原因：①增加照明亮度从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使摄入光线较少，物象显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时必须在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（ｎ＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率ｎ＝1.52）。
光线通过载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射（接物镜油浸系），使视野增加进光量，这样就能使物像更加清晰。
详见图2 ②增加显微镜的分辨率图1 图21.2.2 革兰氏染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。
革兰氏染色和显微镜的使用.
实践操作 普通光学显微镜的使用
显微镜的安置 光源调节
确定观察部位 浸油观察
显微镜使用后处理
• 一手握镜臂，一手托 镜座，保持镜体直立。 放置水平桌面上。
• 坐姿端正，两眼同时 睁开操作，必要时左 眼观察，右眼绘图或 记录。
观察部位的确定
将标本片放在载 物台上，使标本位于 物镜下方。先用低倍 镜观察，转动粗调节 螺旋，缓慢提升镜筒 （或下降载物台）使 物镜与标本距离拉大， 当出现物像时，改用 细调节螺旋，上下微 微移动，直至物像清 晰后，用推进器找到 理想的观察部位。
表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成 像，光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。 而近代光学显微镜就是采用物镜和目镜两组透镜放大而完成的。显微镜的总 放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。B’ A’
两次放大后成倒立的虚像
B’
A’
• 而油镜使用的原理，是 为了减少光线通过玻片 与镜头之间的空气时的 损失。
具体要求：
1. 取出显微镜时应一手握住镜臂一 手拖住底座，使显微镜保持直立、 平稳。放置在水平桌面. 2.初学者遵循从低倍镜到高倍镜再 到油镜的观察过程. 3.选择合适观察部位在油镜下得到 较清晰图像
4.观察完毕镜头擦拭干净放回原处
实训材料与仪器： 普通光学显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
细菌芽孢染色等 细菌负染色、酵母染色等
细胞质染色、细胞的嗜酸 性颗粒染色
单染色等 荧光染色 负染色
项目二 染色与细菌细胞形态观察
微生物染色种类是非常多的，但一般分为单 染色法和复染色法两种。 前者用一种染料使微生 物染色，利于显微镜下观察但不能鉴别微生物。 复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别 微生物的作用，故亦称鉴别染色法。
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
显微镜的使用、细菌单染色及革兰氏染色
实验三显微镜的使用、细菌单染色及革兰氏染色姓名：贾晓霖学号：201000140032班级：生科10.1同组者：李江湲程子修洪钧烨一、实验目的1、学习显微镜（油镜）的使用方法。
2、学习微生物制片及染色技术。
3、认识细菌的形态特征。
4、了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色法。
二、实验原理原理一：单染色法单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。
此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。
染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。
此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。
原理二：革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 ％的酒精。
实验二三细菌简单染色和革兰氏染色
四、实验材料
1. 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、 接种环、载玻片、酒精灯等。 2. 石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95％乙醇、番红（沙黄）染液 3. 菌种：表皮球菌、变形杆菌
五、实验内容与步骤
(一)细菌的简单染色步骤
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
1．涂片
取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌 蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌 种(表皮球菌或变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上 涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
(二)细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→ 水洗→复染→水洗→干燥→观察
1．取表皮球菌和变形杆菌(均以无菌操作)分别在同一张载玻 片上做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。
2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4．斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。
取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(表皮球菌或 变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 实验二三细菌简单染色和革兰氏染色
(一)细菌的简单染色步骤 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。
这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7. 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7. 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学 显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
普通光学显微镜的使用和微生物的简单染色
微生物的革兰氏染色 ®请大家做好预习。
返回
C)倒置显微镜
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
显微镜的发展历史（补充内容）：
=》
=》
R.虎克在17世纪中期 制做的复式显微镜
19世纪中期的显微镜
20世纪初期 的显微镜
续上：
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
=》
=》
带自动照相机 的光学显微镜
装有场发射枪的 扫描电子显微镜
超高压透射 电子显微镜
– 媒染：揭去盖玻片,吸
干水, 滴加1-2滴革氏碘液 媒染1min, 轻轻水洗,吸干。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
5、洗脱 – 滴加95%乙醇溶液(或
30%丙酮乙醇脱色),轻轻 摇动玻片至液滴无色,不 要过分脱色(约30秒),立 即轻轻滴加水洗;吸干。 6、复染 – 滴加蕃红染液复染3min, 轻轻滴加水洗; – 吸干载玻片背面及标本 周围水渍,滴上半滴水， 盖上盖玻片,油镜镜检。
2.乘上玻片与物镜间介质折射率积。
n—介质折射率， a—最大折射角的半数
光线投射到物镜的角度愈大，分辨效能就愈大。
物镜的分辨孔径愈大，光波波长愈短，明显的增
强分辨率——如油镜。
返回
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
五、实验任务：
1、观察制备好的装片； 2、每个同学自己动手单染三张片子进
行观察。其中老师检查一片。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
※ 什么是数值孔径？
从物理学角度来看，光学显微镜的分辨率受光 的干涉现象及所用物镜性能的限制。
可表示为：
分辨率（最大可分辨距离）= /2NA
=光波波长 ，NA=数值孔径值（可见光波0.4— 0.7μm） NA=n*Sina
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用
一、实验目的
以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理
1 普通光学显微镜的基本构造
（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放大, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着支持、调节、固定等作用。
2 显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55μm）
n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。
3 油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料
1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻片染色标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验方法与步骤
1 染色细菌玻片的油镜观查
（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2 活菌制片观察
取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。
五、实验报告
油镜使用的原理
六、思考题
1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？
3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
七、实验注意事项
1 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。
当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4 观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。
5 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
6 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
1 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。
2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
1 简单染色的原理
大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。
染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
2 革兰氏染色的原理
革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、实验材料
1 大肠杆菌24h的斜面培养物。
2 葡萄球菌24h的斜面培养物。
3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）
4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）
5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、实验方法和步骤
1、简单染色
(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。
注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3) 固定:于火焰上通过2—3次。
(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。
（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。
（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。
2革兰氏染色
（1）涂片。
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。
（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。
（6）镜检：观察染色结果。
附1 细菌染色法分类
附2 微生物染色常用染料
A 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
B 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
C 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。
D 单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料五、实验报告
1 革兰氏染色的基本原理和意义
2 革兰氏染色成败的关键
六、思考题
1 根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
2 制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3 做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
4 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠。