犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索
骨骼肌细胞原代培养
骨骼肌细胞原代培养骨骼肌细胞是我们身体中最重要的肌肉组织之一，通过细胞的原代培养可以帮助我们更好地研究肌肉的生理和病理过程。
本文将介绍骨骼肌细胞原代培养的方法和意义。
一、骨骼肌细胞原代培养的方法1. 细胞来源骨骼肌细胞可以从人体或动物体内获得。
人体来源的骨骼肌细胞可以通过手术获取，动物来源的骨骼肌细胞可以通过解剖或抽取组织获得。
2. 细胞分离将获得的骨骼肌组织进行消化，分离出单个的骨骼肌细胞。
常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶，通过适当的温度和时间来进行消化。
3. 细胞培养将分离出的骨骼肌细胞放入培养皿中，加入适当的培养基，提供细胞所需的营养物质和生长因子。
培养基的配方和组成会因实验目的的不同而有所差异。
4. 细胞传代原代培养的骨骼肌细胞会在培养过程中逐渐增殖，达到一定的细胞数量后，可以进行细胞传代。
传代可以保持细胞的稳定性和生物学特性。
二、骨骼肌细胞原代培养的意义1. 生理研究通过骨骼肌细胞原代培养，可以研究肌肉的生理功能和调控机制。
例如，可以研究肌肉收缩机制、肌肉代谢和能量平衡等方面的问题。
2. 病理研究骨骼肌细胞原代培养还可以用于研究肌肉疾病的发生机制和治疗方法。
例如，可以利用培养的肌肉细胞模拟某些疾病的发生过程，寻找治疗的靶点和药物。
3. 药物筛选骨骼肌细胞原代培养可以用于药物的筛选和评价。
通过在培养的肌肉细胞中加入不同的药物，观察细胞的反应和变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。
三、骨骼肌细胞原代培养的注意事项1. 细胞来源的选择在进行骨骼肌细胞原代培养前，需要选择合适的细胞来源。
不同的细胞来源可能会影响培养结果和实验的可行性。
2. 培养条件的优化骨骼肌细胞原代培养需要适宜的培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和CO2浓度等。
这些条件需要根据实验的要求进行优化。
3. 细胞的纯度和活性在骨骼肌细胞原代培养过程中，需要保证细胞的纯度和活性。
细胞的纯度可以通过筛选和分离的方法进行提高，细胞的活性可以通过细胞活力试剂盒进行检测。
狗麻醉解剖实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉狗的解剖结构，了解各器官的形态、位置和功能。
2. 掌握狗的麻醉、解剖和操作技巧。
3. 培养学生严谨、细致的实验态度和团队合作精神。
二、实验材料与设备1. 实验动物：健康成年狗一只（雌性，体重约10kg）。
2. 实验器材：麻醉机、手术刀、剪刀、镊子、针筒、注射器、解剖器械、生理盐水、碘伏、酒精、纱布等。
3. 实验药品：普鲁卡因、利多卡因、肾上腺素、生理盐水等。
三、实验步骤1. 麻醉：（1）首先对狗进行全身麻醉，采用静脉注射普鲁卡因和利多卡因的混合液。
（2）麻醉成功后，将狗置于解剖台上，固定四肢，准备进行解剖。
2. 解剖：（1）皮肤：观察狗的皮肤颜色、厚度和弹性，注意皮肤与肌肉的连接方式。
（2）肌肉：分离皮肤与肌肉，观察肌肉的形态、颜色和纹理，了解肌肉的起止点和作用。
（3）骨骼：分离肌肉，暴露骨骼，观察骨骼的形态、大小和连接方式，了解骨骼的支撑和保护作用。
（4）内脏器官：a. 消化系统：观察胃、小肠、大肠、肝脏、胆囊、胰腺等器官的位置、形态和功能。
b. 呼吸系统：观察气管、支气管、肺等器官的位置、形态和功能。
c. 循环系统：观察心脏、血管、淋巴等器官的位置、形态和功能。
d. 泌尿系统：观察肾脏、输尿管、膀胱等器官的位置、形态和功能。
e. 生殖系统：观察卵巢、输卵管、子宫、睾丸、附睾等器官的位置、形态和功能。
f. 神经系统：观察大脑、脊髓、神经等器官的位置、形态和功能。
g. 感觉器官：观察眼睛、耳朵、鼻子等器官的位置、形态和功能。
（5）神经系统：观察大脑、脊髓、神经等器官的位置、形态和功能。
3. 组织切片：（1）取狗的器官组织，如肝脏、肾脏、心脏等，进行固定、脱水、透明、浸蜡、切片、染色等步骤。
（2）在显微镜下观察组织切片，了解器官组织的微观结构。
4. 总结与讨论：（1）总结实验过程中观察到的狗的解剖结构特点。
（2）分析狗的器官功能与人体器官功能的异同。
（3）讨论实验过程中遇到的问题和解决方法。
MDCK细胞介绍
MDCK细胞介绍（MDCK Cells introduction）MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。
犬肾上皮连续细胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 细胞株购买信息：ATCC MDCK cell lines。
目前，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒)、腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒)及禽流感病毒等。
由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。
传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。
然而，血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批次间的质量难以严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量；此外，血清来源困难、价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。
犬肾细胞MDCK无血清培养基 UltraMDCK Serum-free Medium 产品介绍MDCK无血清培养基是一种在经过优化的基础培养基中只添加了重组人胰岛素蛋白和牛转铁蛋白的低蛋白含量的成分配制而成的SFM培养基。
与在含有血清生长环境中相比，在MDCK 无血清培养基中生长的MDCK细胞较小并紧密成团。
在不更换培养基的条件下，MDCK细胞可以持续旺盛生长至少2周时间。
经过MDCK细胞的持续生长，从单层细胞形成球形结构，通常我们称这种球形结构为“漂浮物”。
实训报告狗解剖
一、实训背景随着我国宠物行业的快速发展，宠物医学专业逐渐成为热门专业。
为了提高学生的动手实践能力，培养具备专业技能的宠物医学人才，我校特组织开展了狗解剖实训课程。
本次实训旨在让学生了解狗的解剖结构，掌握解剖方法，提高宠物医学专业的实践教学水平。
二、实训目的1. 了解狗的解剖结构，掌握狗的各个器官系统的分布和功能。
2. 熟练掌握狗解剖的基本方法，提高学生的动手实践能力。
3. 培养学生的科学思维和创新能力，为今后从事宠物医学工作打下坚实基础。
三、实训内容1. 狗的全身骨骼解剖2. 狗的肌肉系统解剖3. 狗的皮肤与毛发解剖4. 狗的消化系统解剖5. 狗的呼吸系统解剖6. 狗的循环系统解剖7. 狗的泌尿系统解剖8. 狗的生殖系统解剖9. 狗的神经系统和感觉器官解剖10. 狗的内分泌系统解剖四、实训过程1. 实训前准备在实训前，教师向学生讲解实训的目的、内容、方法和注意事项。
学生提前预习相关理论知识，了解狗的解剖结构。
2. 实训操作（1）全身骨骼解剖：学生按照教师指导，逐步剥离狗的皮肤、肌肉和内脏，观察狗的骨骼结构，了解骨骼系统的分布和功能。
（2）肌肉系统解剖：学生继续剥离狗的肌肉，观察肌肉的起止点、走向和功能，了解肌肉系统的协调作用。
（3）皮肤与毛发解剖：学生观察狗的皮肤结构和毛发分布，了解皮肤的保护、调节体温和感觉功能。
（4）消化系统解剖：学生解剖狗的消化器官，观察胃、肠、肝脏、胆囊等器官的结构和功能。
（5）呼吸系统解剖：学生解剖狗的呼吸道，观察鼻腔、喉、气管、支气管和肺的结构和功能。
（6）循环系统解剖：学生解剖狗的心脏、血管，观察心脏的结构和功能，了解血液循环过程。
（7）泌尿系统解剖：学生解剖狗的肾脏、输尿管和膀胱，了解泌尿系统的结构和功能。
（8）生殖系统解剖：学生解剖狗的生殖器官，观察雌雄生殖器官的结构和功能。
（9）神经系统和感觉器官解剖：学生解剖狗的大脑、脊髓、神经和感觉器官，了解神经系统的结构和功能。
犬体细胞克隆研究
１９ 英 国罗 斯林 研 究所 Ｗｉ ｔ ９７年 ｌ 等成 功 获得 １ 超数 排卵 和卵母 细胞质量 ｍｕ ． １
世界首例体细胞克隆绵羊（ ｏｙ ， Ｄ ｌ ）打破了长期 以来 ｌ
犬 卵母 细胞 体 外成 熟 （ｖ 效 率 比其 它哺 乳动 ｉＭ）
认为成年动物体细胞不具备发育全能性的假说 。克 物和实 验动物低【 。至 目前无 利用体外成熟 卵母细
的融合 和激活 、重构 胚胎 的体外 发育 以及重 构胚 胎 卵母细 胞 的细胞质 黑而 均匀致 密 ，而早 期 老龄化 卵 移 植人受 体动 物 中并妊娠 产仔 。在 ２０ ０６年 ， 世界 首 母 细胞 、中等 老龄 化卵母 细胞 及 严重 老龄化 卵母 细
胞 中卯周 隙逐 渐增大 ，透 明带 和卵丘 细胞 也逐 渐老
目前 ， 物体 细胞克 隆技术 的主要 环节 包括 ： 动 供 依据形态学标准， 即卵周缝（Ｖ ） Ｐ Ｓ大小及第 １ 极体存 可 体细胞的培养和准备 、 受体卵母细胞的体外成熟及 在 与否 ，来判 断 卵母细 胞成 熟状 态 。从 图 １ 以看
去核、 供体细胞核移植入去核卵母细胞 中、 重构胚胎 出 ， 成熟 卵母 细胞 的细胞质 黑但 不均 匀致 密 ， 未 成熟
物卵母细胞中， 构建新的重组胚胎， 进而使重构胚胎 效率较低 ， 难度大。如犬卵母细胞体外成熟效率低 ， 胚胎细胞核 ） 观察效率低 ， 体外胚 发育为与供体核细胞基因型相同后代的技术过程 。 犬卵母细胞核相（
动 物体 细胞 克 隆可 以使 动物 不需 要 经过 有 性 繁殖 ， 胎 培养体 系不完 善 ， 重构胚 胎很 难进行体 外发育 。以 即不 需要 雄性动 物 的精 子和 雌性 动物 的卵母 细胞 的 下详 细介绍 目前影 响犬体 细胞克 隆 的因素 。 受精 过程而产 生动 物后代 。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
·1216·
中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
犬疑似大量骨质溶解症的病理组织学观察
操 作［ ］ １ 。在试 验 中发 现 若 是 在 插入 聚丙 烯 缝 合 线 之 前静 脉注射 适 量 的速 尿 ， 尿 管 会 因为 尿 流量 大 输
增 而 增 粗 ， 尿 管 口开 张 ， 对 比 较 容 易 将 ３ ０聚 输 相 — 丙 烯 缝 合 线 插 人 输 尿 管 。插 入 后 再 行 其 他 操 作 就 方 便 得 多 了 。术 后 １月 左 右 对 施 行 输 尿 管 膀 胱 吻 合 术 的猫 进 行 剖 检 ， 膀 胱 外 肉 眼 看 不 到 明 显 的 输 尿 管 从
迫作用 ， 快就 可止 血 。 很 参考 文献 ：
［］ Ｇｒｇｒ １ ｅｏ ｙＣＲ，Ｇｏ ｒ ｙＩＭ ，Ｋ ｃ ｉ Ｅ Ｊ ｅ １ ｕｌ ｅ ｏ ｈｎ ， ｔ ．Ｒｅａ ｒｎ— ａ ｎｌ ａｓ ｔ
ｐ ａ ｔ ｔ ｎ ｆ ｒ ｔ ｅ ｔｅ ｔ ｎ ｆｅ ｄ ｌ ｎ ａ ｉ ｏ ｈ ｒ ａ ｍｅ ｔｏ ｎ — ｓ ａ ｅ ｒ ｎ ｌ ａ ｌ ｒ ｎ ｃ ｔ ｏ ｔ ｇ ｅ ａ ｉｕ ｅ ｉ ａ ｓ ｆ
ｐ ｌ ｅｓ ｔｒ ） 为 支 撑 物 ， 后 再 进 行 相 应 的 手 术 ｙｅ ｕｕｅ 作 ｎ 然
于输 尿 管动脉 非 常的细小 ， 手术 中未 能结扎 确实 。 在 其他 两种 术式 ， 尿 管均 剪 开 ， 且 与 黏 膜缝 合 ， 输 并 输
尿管 动脉 被包埋 在膀 胱黏 膜下 ， 即使 有 出血 ， 由于压
１１ 材料 病 犬 杂交 京 巴犬 ， ． ８岁 ， 性 。 于 ２ ０ 雄 ０６ 年 ８月 份 开 始 ， 后 肢 跛 行 ， 佛 山 某 宠 物 医 院 就 左 去
道 的约有 ３ ０ 。近几年我 国也有 多个 病例报 道 ， ０例 但 在小动物 临床 尚未 见 相关 报 道 。Ｊ ｈ ｓｎ和 Ｍｃｌｒ ｏ ｎｏ ｃ ｅ ｕ 于 １５ ９ ８年将本病 命 名 为大 量 骨质 溶 解症 ， 现被 广 泛 采用 。根据 医学 临床 资 料 显示 ， ＭＯＬ可 发 生 于任 何 年龄 ， 特别好发 于 ５ ５岁 的儿 童 和 青少 年 ， 种 族 ～２ 无 及性 别差 异 ， 明显 遗 传倾 向。一 般 是 慢 性 进 展 病 无 程 ， 长可达 ２ 最 ５年 ， 全身 各 部位 骨 均 可发 病 ， 变 骨 病
犬的解剖实验报告-精品
【关键字】方法、认识、难点、系统、平稳、保持、统一、发现、掌握、了解、特点、位置、需要、项目、作用、结构、关系、增强、分析、调节、指导、加强、中心犬的解剖实验报告篇一：动物解剖生理实验指导实验内容实验一、显微镜的使用、组织切片的显微观察实验二、犬骨骼的观察、骨骼辨认测试实验三、血液的凝固实验四、红细胞的脆性试验实验五、蛙心活动观察实验六、红细胞计数实验七、反射弧分析及脊髓反射活动观察(原文来自：小草范文网:犬的解剖实验报告) 实验八、胃肠运动观察和小肠吸收观察实验一显微镜的构造、使用和保养[实验目的]了解显微镜的基本构造，掌握显微镜的使用方法和保养方法。
[材料设备]显微镜、组织切片、擦镜纸等。
[方法步骤]（一）机械部分1、镜筒2、物镜转换器3、镜臂4、调焦器5、载物台6、镜柱7、镜座（二）光学系统部分光镜的光学系统主要包括物镜、目镜和照明装置（反光镜、聚光器和光圈等）。
1、目镜：常见的有5×、10×和15×（×表示放大倍数）的目镜，可根据不同的需要选择使用，最常使用的是10×目镜。
2、物镜：常用物镜的放大倍数有10×、40×和100×等几种。
一般将8×或10×的物镜称为低倍镜（而将5×以下的叫做放大镜）；将40×或45×的称为高倍镜；将90×或100×的称为油镜（这种镜头在使用时需浸在镜油中）。
图1-3 物镜的性能参数及工作距离C 线为盖玻片的的上表面，10?物镜的工作距离为7.63mm；40?物镜的工作距离为0.198mm；10/0.25、40/0.65、100/1.25表示镜头的放大倍数和数字孔径。
160/0.17表示镜筒长度为160mm，盖玻片厚度为0.17mm。
3、聚光器：调节光线的强弱，升高聚光器可使光线增强，反之则光线变弱。
光圈能控制进入聚光器的光束大小的可变光阑。
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犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：苏冠华,刘启云, 卢永昕, 米少华, 孙雨霏, 刘晓明,帅欣欣【摘要】目的: 探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMs）体外分离、纯化及培养方法的改良并研究其生物学特性。
方法: 采用机械分离结合Ⅱ型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞, 经差速贴壁法纯化后, 在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM）中进行原代和传代培养, 免疫细胞化学染色鉴定。
结果: 改良后的培养方法适于获取犬骨骼肌成肌细胞, SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外培养。
SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。
结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性, 纯度在90%以上。
结论: 通过改良后的双酶一步消化法获得的SkMs 在合适的培养条件下能够增殖、分化并保持其生物学特性, 为其在基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。
【关键词】犬; 骨骼肌成肌细胞; 细胞培养; 生物学特性1961年, Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞（muscle satellite cells）。
从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblasts, SkMs)。
来源于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点［1］。
因此, 成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。
本研究以获取基因治疗载体SkMs为目的, 探讨建立简便、经济的成肌细胞分离、纯化及培养方法。
1 材料和方法1.1 材料实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
中性蛋白酶购自美国Roche公司, Ⅱ型胶原酶、结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自美国Sigma公司; SKBM培养基和SKGM Bullet Kit购自美国Lonza公司; 亲和素生物素过氧化物复合物法（avidin biotin complex, ABC）免疫组化试剂盒购自美国Vector 公司, DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司; 胰蛋白酶、 DMEM、M199培养基购自美国Hyclone公司; 胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）, 小牛血清购自美国Gibco公司。
1.2 方法1.2.1 SkMs的原代培养完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM∶DMEM∶FBS＝70∶25∶5配制。
无菌全麻下自5～8 kg左右杂种犬股四头肌取3～5 g肌肉, 将其移入盛有PBS的90 mm培养皿中剔除筋膜、脂肪、肌腱和血管组织后剪为碎糜状, 将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中性蛋白酶和1 g/L Ⅱ型胶原酶混合消化酶溶液的100 mL玻璃瓶中, 37℃恒温摇床60 r/min, 1 h。
然后吸取9 mL上清液经孔径75 μm 的不锈钢网筛（200目）过滤到10 mL玻璃离心管中, 再加入1 mL FBS 中和, 1 000 r/min, 离心5 min, 弃上清。
加70SKGM培养基重悬细胞沉淀, 种入明胶预包被的培养瓶。
再加入双酶溶液重复消化上述剩余的组织块, 反复3～4次。
计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。
2 d 后换液, 以后每2～3 d换液1次, 在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。
1.2.2 SkMs的传代培养及纯化倒置显微镜下观察细胞生长情况, 当细胞生长到培养瓶面积的70%～80%时, 以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化, 中止消化后离心, 重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶, 静置于培养箱内约8～10 min后取出, 轻轻晃动培养瓶, 动员未贴壁的细胞, 吸出培养液接种另一培养瓶, 反复差速3次。
最后按1∶2或1∶3比例进行传代, 每2～3 d换液1次。
4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活率。
1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定取处于对数生长期的细胞, 用上述EDTA/胰酶溶液消化后制成单细胞悬液, 细胞计数后以5×103细胞/孔接种于24孔板, 共接种8组, 每组3孔, 每天取一组细胞进行计数, 计算平均值, 连续8 d, 绘成细胞生长曲线。
未计数孔细胞每2～3 d换液1次。
1.2.4 SkMs的诱导分化取培养至第2～3代的细胞, 消化后以1×105细胞/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中, 加入生长培养基进行培养, 待细胞分裂、增殖至70%～80%汇合后, 加入分化培养基（含200 mL/L FBS的M199培养基）继续培养, 倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。
1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色将细胞接种于有盖玻片的6孔板, 待长至培养面积的80%取盖玻片。
40 g/L多聚甲醛固定后, 以ABC法行免疫化学染色, 以鼠抗desmin mAb为一抗, DAB显色。
1.2.6 差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞desmin阳性数比较取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶, 差速贴壁纯化组与非差速贴壁组各2瓶, 制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。
每组取4片, 每片随机取5 个视野进行采样, 以Olympus BX50 显微摄像系统进行阳性细胞计数, 所得数据以χ2检验进行统计学处理。
2 结果2.1 SkMs体外培养的生物学特点经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点, 悬浮于培养液中。
有活力的细胞能够在48 h内完全贴壁, 变扁并向四周伸展而成为一梭形或纺锤形细胞, 有折光性（图1A）。
约3～4 d后进入对数生长期（图1B）, 6～7 d后因接触抑制生长速度减慢。
细胞增多后逐渐按一定方向呈有序排列。
2.2 骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定2.2.1 多核肌管形成在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时, 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图2）。
2.2.2 desmin细胞免疫化学染色差速纯化后培养的成肌细胞经desmin进行免疫化学染色（DAB 显色）, 成肌细胞胞质呈阳性反应, 细胞核外周及胞质呈棕黄色, 表明培养的细胞为成肌细胞（图3）。
多核肌管呈强阳性。
2.3 成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制原代细胞进行台盼兰染色, 结果发现97%以上的细胞均不着色, 表明本实验方法培养的细胞存活率高。
细胞连续计数所绘制的成肌细胞生长曲线显示: 细胞在培养的3～5 d增殖达高峰, 5～7 d后基本达生长平台期。
2.4 成肌细胞的差速纯化将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行desmin免疫化学染色, 发现两组阳性细胞数有显著差异, 经计算得χ2值为5.47, P0.05为具有统计学意义。
3 讨论SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。
当骨骼肌受损伤时, 可被启动形成新的骨骼肌纤维［2］。
一般来讲, 肌肉来源的动物越老, 分离肌肉细胞所需要的时间越长, 而且单个核前体细胞的产量也越低。
国内大多数研究取成年犬的骨骼肌组织坚韧, 同时由于成肌细胞量少, 提取困难。
本实验综合国内外研究经验, 采用了约5～8 kg的未成年犬进行原代培养, 产量较高。
目前提取犬成肌细胞大多采用机械分解法结合三步消化法［3］（I 型胶原酶, 透明质酸酶, 链霉蛋白酶）或二步消化法［4］（I 型或IV 型胶原酶+胰蛋白酶）获得单细胞悬液, 步骤繁琐, 成本均较高。
蛋白水解酶如胰蛋白酶, 链霉蛋白酶等往往还存在可能损伤细胞、在孵育的过程中不稳定、可能成为支原体污染的来源等缺点。
而中性蛋白酶则能够克服以上缺点。
故本研究创新性地采用中性蛋白酶/Ⅱ型胶原酶混合酶溶液一步消化法, 大大简化了流程并以较少的代价获得足量的原代成肌细胞。
研究认为, 原代细胞中混有大量的成纤维细胞, 既往为提高纯度往往采用不连续密度梯度离心法［5］、免疫磁珠分离法［6］、不完全消化法等方法, 但均以操作复杂、产量低或价格昂贵为代价。
差速贴壁操作方法简单有效, 具有很大的适用性。
原理是利用成纤维细胞的贴壁能力强于成肌细胞, 10 min左右即可贴壁, 而成肌细胞多数仍处于悬浮状态, 此时移出培养液, 即为纯化的成肌细胞。
本实验中采用3次预贴壁, 每次10 min进行差速纯化获得的成肌细胞经鉴定阳性率均在90%以上, 符合组织工程基因治疗的纯度要求。
据已有文献报道, 不同种属动物SkMs的最佳培养条件不同。
目前犬SkMs常用的生长培养基有M199, MEM, DMEM, F12以及RPMI1640等。
SkMs体外增殖、分化除受血清浓度改变的影响之外, 还要受到多种因子的调节, 如胰岛素、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EDF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等。
研究证实［7］, 在不含任何生长因子的DMEM、M199等生长培养基进行培养时, 原代细胞中混杂的成纤维细胞迅速生长, 并随着传代次数的增多呈几何级数增长逐渐占据优势。
包含特定生长因子的生长培养基更适合于SkMs的增殖培养。
SKGM 培养基中含有胰岛素, EGF, 地塞米松等成分则可明显地促进成肌细胞的增殖、生长。
因此, 本课题组在国内首次采用了SKGM培养基进行原代培养, 结果发现成肌细胞逐渐呈现选择性生长优势并成为原代培养物中的主导细胞类型, 并且随着时间延长, 肌源性细胞逐渐增多, SkMs的纯度和增殖活力明显优于M199、DMEM等其他传统的生长培养基。
成肌细胞在长轴方向融合, 形成细胞核在中央, 肌丝在周边的多核肌管是鉴定的重要依据。
本研究在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时, 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管, 初步证明成肌细胞体外培养成功。
同时, 肌管可以有一些粗短的分支, 这一点与心肌组织的发育相类似, 也提示骨骼肌来源的成肌细胞可以作为心肌组织的前体细胞用于心肌组织工程研究。
结蛋白（desmin）是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一, 它是最早表达的肌源性标志蛋白［8］。
用免疫细胞化学染色方法检测细胞有无desmin表达是目前所知的鉴定SkMs的最佳方法。
本实验研究采用desmin染色显示, SkMs呈阳性, 而多核肌管呈强阳性。
成肌细胞是哺乳动物体内惟一能大量分裂、增殖及迁移的前体细胞, 具有与宿主肌纤维融合的能力, 可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。
目前已经通过基因工程获得能表达人类Ⅸ因子（hFⅨ）、人生长激素（hGH）、红细胞生成素（EPO）、克隆形成刺激因子（CSF1）及IGF等基因产物的成肌细胞株。