RTPCR和western Blot
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步调及问题解答)之樊仲川亿创作Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产品，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步调五、一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采取的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标识表记标帜的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能坚持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标识表记标帜的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现经常使用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操纵也比较简单，原理如下（二抗用HRP标识表记标帜）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保管。
严格核实PH不得超出7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超出两个月，隔几个月须重新配制。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
qRT-PCR和WesternBlot常见问题解决-李晔——【RT-PCR技术】
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Quantion 5 熔解曲线不止一个主峰
1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
制胶：将玻璃板清水洗净，固定在电泳槽上，并验漏。 分离胶 (20mL) ：H2O 7.9mL、30% Acrylamlde 6.7mL、1.5M Tris-HCl PH8.8 5.0mL、10% SDS 0.2mL、10% 过硫酸胺 0.2mL、TEMED 0.008mL
加入分离胶后用正丁醇覆盖，待胶凝固后倒出。 浓缩胶 (4mL) ： H2O 2.7mL、30% Acrylamlde 0.67mL、1.5M Tris-HCl PH6.8 0.5mL、 10% SDS 0.04mL、10% 过硫酸胺 0.04mL、TEMED 0.004mL
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释 标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
Quantion 4 阴性对照也出现明显的起飞
1.mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲 线进行分析。
扩增曲线 样品放置
定量结果分析：扩增曲线
率先到达CT值得RNA浓度较高，模板较好，内参的CT值一般为10到16之间。
定量结果分析：溶解曲线
出现杂峰引物需要重新设计
单一峰引物特异性较好
RTpcr技术的原理
RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。
逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。
这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。
1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。
整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。
2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。
逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。
逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。
2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。
3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。
4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。
3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。
PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。
PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。
通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
PCR,RT-RCR,westernblot,southernblot
Three kinds of Primers
1. Gene specific primers
2. Brief primer 3. Random primer
Amino acid sequence MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQ Base sequence： attccgccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttg tcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcat cctgtctcggattgtggga
RT—PCR
RT primer:
1、Oligo(dT)15-18
5'—TTTTTTTTTTTTTTTTTT—3'
2、 Specific anti-sense primer
5' AAAAAn 3'
RT-PCR product
Southern blot analysis
Southern Blot Analysis
Northern blot analysis
Procedure of Northern Blot：
28S
18S
Northern Blot Analysis
Northern blot can: 1. Detect the size of specific mRNA transcripts
2. Determine the genes expressed in the cells
—3'
Nonspecific sequence can be added
RTPCR的基本原理
RTPCR的基本原理一、什么是RTPCRRTPCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，常用于检测RNA的数量和序列特征。
通过该技术，可以对RNA进行逆转录合成DNA，然后利用聚合酶链反应（PCR）放大DNA的特定片段。
RTPCR技术在医学、生物学和疾病诊断领域具有广泛的应用。
二、RTPCR的基本步骤RTPCR技术主要包括逆转录、PCR放大和检测三个步骤。
1. 逆转录逆转录是将RNA转录为DNA的过程。
在逆转录过程中，需要使用逆转录酶、RNA 模板和引物（primers）进行反应。
逆转录酶能够将RNA模板中的核苷酸序列反转录成互补的DNA链。
引物是一小段DNA或RNA序列，在逆转录过程中与RNA模板发生互补配对，作为起始合成新DNA链的起点。
2. PCR放大PCR放大是将逆转录得到的DNA片段进行指数级扩增的过程。
在PCR反应体系中，需要加入逆转录产物、DNA聚合酶、引物和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）。
PCR 反应通过循环加热和冷却的步骤，在不同温度下引发DNA的分离、复性和扩增。
反复的PCR循环能够使目标DNA片段的数量成倍增加。
3. 检测PCR放大后的DNA片段可以进行进一步的检测和分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、荧光探针或荧光染料结合等技术。
通过这些方法，可以检测到目标DNA片段的数量和特异性。
三、RTPCR的应用RTPCR技术在医学和生物学领域有广泛的应用。
1. 疾病诊断RTPCR可以检测病原体的基因序列，用于疾病的早期诊断和追踪。
例如，在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情中，RTPCR被广泛应用于检测病毒的核酸，以帮助诊断和追踪病例。
2. 基因表达分析RTPCR可以检测和分析基因的表达水平。
通过检测特定基因的转录水平，可以了解基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达差异。
这对于研究基因功能和调控机制非常重要。
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一、RT-PCR步骤RNA提取（-70℃保存）
1. 组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）
2. 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min
3. 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min
4. 10000 rpm 4℃离心15min
5. 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min
6. 12000rpm 4℃离心15min
7. 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm 4℃离心5min
8. 倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥
9. 加20ul DEPC水至EP管中
10. 在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解测RNA浓度
二、上机操作
1．10ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心
Template 1ul
Primer 1 3ul
Primer 2 3ul
Master 5ul
ddH2O 补至10ul
2.PCR循环:
Stage1：预变性
95℃30s
Stage2：PCR反应
95℃5s
60℃20s
40 Cycles
2.3 Western Blot检测蛋白变化
2.3.1 蛋白样品制备
2.3.1.2 裂解蛋白
1)适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。
一般100mg组织加1mlRIPA+10ulPMSF
2) 将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。
12000r/min 4℃离心15min。
离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。
可-80℃保存。
2.3.1.3 蛋白浓度测定及蛋白样品制备
1) 分别向5 个1.5ml 的EP 管中加入无菌水800μl；然后加入BSA（2mg/ml）标准蛋白，分别为0、1、2、4、8μl；
2) 向0.5ml 的EP 管中加入400μl无菌水，然后加入1μl 蛋白样品；
3) 向标准管和样品管中分别加入200μl和100μl 蛋白染液；
4) 上下颠倒混匀EP管中的溶液；
5) 从每管中取出200μl 混合液加入96 孔板内中；
6) 使用酶标仪测定吸光值；
7) 依据标准蛋白吸光值绘制蛋白标准曲线，然后计算出蛋白样品的浓度；
8) 制备一定质量的蛋白样品，进行Western Blot检测；
9) 蛋白样品95℃变性5min，保存在-20℃的冰箱在或直接进行SDS凝胶电泳。
2.3.2 SDS-PAGE
2.3.2.1制胶
根据配方配制所需的12%分离胶和5%浓缩胶。
2.3.2.2 灌胶
10) 清洁玻璃板，然后固定于制胶器中，用水检测是否密封，然后开始灌胶；
11) 加入12%分离胶7 ml，再加入水饱和正丁醇200 μl消泡并隔绝空气。
，等一段时间后分离胶凝固，倒出正丁醇，去离子水冲洗净残留的正丁醇，加入5%浓缩胶并插入与玻璃板规格匹配的梳子；
12) 浓缩胶凝固后，小心拔出梳子，待用。
2.3.2.3 上样
将样品在95℃下变性5 min，然后加入到加样孔中，电泳槽中的缓冲液是1×Running Buffer。
2.3.2.4
90 V电压下样品被压缩到浓缩胶与分离胶的分界处，然后将电压提高为120 V，当溴酚蓝跑至玻璃板边缘处停止电泳。
2.3.3 转膜
1) 根据胶的大小裁剪PVDF膜并做好标记，使用前甲醇活化1 min；
2) 将转膜使用的滤纸、垫子、夹子以及活化好的PVDF膜浸泡在转膜缓冲液中。
3) 从电泳槽中拿出玻璃板并用切胶器撬开，去掉浓缩胶以及多余的分离胶部分，将剩下的分离胶移入转膜缓冲液中；
4) 在转膜的夹子上，先放垫子，然后滤纸，再在滤纸上放胶、最后PVDF正面盖上胶，用切胶器去除PVDF膜和胶之间的气泡，然后再盖上滤纸和垫子，合上夹子，放进转膜槽中，加适量-20℃预冷的转膜缓冲液。
电压150 V转膜2-3 h，期间转膜槽需冰浴，避免转膜过程产热影响转膜效果；
5) 转膜结束后用镊子取出PVDF膜，丽春红染色，观察转膜效果，然后用1×PBS-T脱色。
6) 5%脱脂奶粉溶液封闭PVDF膜，摇床上缓慢摇动孵育1h后，倒掉脱脂奶粉溶液，1×PBS-T洗PVDF膜，5 min/次，洗三次；
2.3.4 免疫反应
1) 用一抗稀释液孵育PVDF膜，在4℃冰箱中，摇床上缓慢摇动孵育过夜；
2) 回收一抗溶液，然后用1×PBS-T洗膜，10 min/次，洗2次；
3) 将膜置于3%脱脂奶粉稀释的二抗溶液中孵育1 h，弃二抗，1×PBS-T液洗膜，10 min/次，洗3次；
2.3.5显影：
等体积混合Millipore Immobilon Western 化学发光HRP底物A液和B液，将PVDF膜浸在液体，孵育5 min，然后用保鲜膜包好，用吸水纸吸去残余液体，膜正面朝上固定在压片夹中，暗室中将感光胶片放入压片夹中，适当时间后，取出胶片放入显影机中显影。