【CN109706270A】一种鸡安卡拉病检测方法【专利】
一起鸡安卡拉病的诊治
山东畜牧山东畜牧兽医兽医 2019年第40卷34一起鸡安卡拉病的诊治李心海 迟 兰 （徐州生物工程职业技术学院 江苏 徐州 221000）中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1007-1733(2019)10-0034-02 目前，我国许多省份和地区都出现了鸡安卡拉病的发生和流行，且死亡率很高。
鸡安卡拉病是一种以心包积液和肝出血、坏死为特征的传染病。
易感动物包括蛋鸡，肉鸡，甚至鸭和鹅等。
它严重影响了我国家禽养殖业的健康发展。
鸡安卡拉病1987年首次流行于巴基斯坦的安卡拉小镇，从那时起，这种疾病相继在世界许多地方发生。
安卡拉病的病原体是禽类腺病毒1群4型，20~80日龄的鸡只易感多发。
该疾病的临诊症状主要表现为饮水量增加，鸡冠苍白色，羽毛蓬松，呼吸困难，精神状况差，排稀粪。
病鸡的病理变化主要为肾出血，胰出血，肺水肿，肺淤血。
几乎所有患病的鸡都出现心包大量积液，肝脏颜色变黄，肿胀，肝细胞坏死，所以鸡安卡拉病也被称为心包积水-肝炎综合征。
1997年，这种疾病传入中国。
自2015年以来，湖北、广西、河南、江苏、四川、安徽等多个省份出现了安卡拉鸡病。
易感品种也从“三黄鸡”和“麻鸡”发展到几乎所有鸡品种。
肉鸡的病死率为20%~80%，280日龄的育种鸡和蛋鸡也会发病，但死亡率很低。
2019年6月徐州地区某养鸡场发生鸡安卡拉病，笔者对该病进行了诊断与治疗，收到较好的效果。
1 发病情况某一蛋鸡养殖场，品种为罗曼蛋鸡，养殖量18000只，70日龄，已持续发病13d ，6月10日50日龄开始出现病情，每日死亡30只左右，到6月14日死亡约240只，至6月18日死亡约550只；6月18日至6月20日共死亡2000只，6月21日至6月23日共死亡约2200只。
病死超过5000只，损失惨重。
2 免疫及预防用药过程见附表。
3 临诊症状在疾病早期阶段没有出现明显的症状。
急性发病病鸡一般会突然死亡，呼吸困难和气管中发出水泡音等呼吸道症状。
鸡安卡拉病表现及防治
2021年第3期 吉林畜牧兽医57·禽业专栏·QinYe ZhuanLan鸡安卡拉病表现及防治刘丽敏吉林省公主岭市兽药饲料监察所，吉林公主岭 136100安卡拉是一种病毒，也叫心包积水症，在巴基斯坦所发现的新鸡病，主要危害是3～6周龄的肉鸡，而后备的母鸡或是鸡蛋偶尔也会发生。
也就是说其实安卡拉病是一种传染性的禽类疾病，它可垂直传播，也可水平传播。
鸡一旦感染就很有可能会成为终身的带毒者，而且会间接性的排毒。
因此这种禽类传染疾病，会给鸡群养殖户带来经济上的巨大损失及其威胁的一种突发性的感染疾病。
1 鸡安卡拉病概述安卡拉病毒在1985年时就有散发病例。
该病是在卡拉奇附近的一个肉鸡场的安卡拉地区发生流行的，在1988年时扩散到全巴基斯坦，造成了进亿只肉鸡死亡，因此该病会造成大范围内批量的死亡。
该病非常的猖獗，在死亡高峰期有25%以上的肉鸡生产者破产，造成了巨大的经济损失。
在目前的安卡拉病防治中，暂未发现有效的治疗药物，相对来说还是以防范为主。
在近些年，安卡拉病出现的频率很高，这就需要我们对安卡拉病进行更加深入的探讨和研究，以此来防范鸡安卡拉病。
2 鸡安卡拉病表现该病主要发生在1～3周龄的肉鸡和麻鸡等，其中也可见于鸡蛋和肉种鸡，以5～7周龄最为多发。
主要侵害的是肾脏、脾脏以及肝脏，且潜伏期短，发病快。
该病主要特征是精神沉郁，羽毛成束，没有明显的先兆便会突然倒地，在数分钟内便会死亡。
在死亡前，还会出现呼吸道症状，呼吸加快，会排出黄色稀粪，两腿划空行为，有神经症状，部分会有啰音，其主要以中等和偏大的鸡为主。
会出现外观发黑、部分有气囊炎和肺淤血水肿，脾脏轻微肿大且可视黏膜变浅，但肠道不会有明显的变化，因此养殖人员一般很难发现。
3 鸡安卡拉病防治通常这种病主要还是以对症治疗为主，会采用抗病毒，保肝护肾，强心利尿以及控制继发感染等治疗。
同时对于防治方面以强化饲养管理，加强药物的治疗或是提高机体的免疫力。
一例肉鸡安卡拉病的诊断与防治
一例肉鸡安卡拉病的诊断与防治作者：曹立辉王春肖薛军训冯欣璞张晓云来源：《中国动物保健》2022年第12期摘要：鸡的安卡拉病是由I群腺病毒引起的急性高度致死性传染病，死亡迅速，流行面广，给养禽业造成巨大的经济损失，严重影响养禽业的健康发展。
本病例从流行情况、病理变化、实验室检测确诊为肉鸡安卡拉病，通过增强机体免疫力治疗方案，最终治愈，降低了养殖户的经济损失。
关键词：肉鸡；安卡拉；腺病毒；PCR诊断；防治安卡拉病因1987年3月在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉地区一个肉鸡场发生暴发流行而得名[1-3]。
安卡拉病也叫“鸡心包积液综合征、心包积液一肝炎症”，是一种禽腺病毒血清4型感染引起的疾病，在肉鸡上发病较多，而近两年产蛋鸡和青年蛋鸡也时常感染并造成一定死亡，造成巨大经济损失，早发现早治疗可降低经济损失[4-6]。
石家庄某县一肉鸡养殖户送来病鸡就诊，经过解剖、病理变化观察及实验室诊断，最终确诊为肉鸡安卡拉病。
1 主诉及基本情况该养殖户共饲养双A+/罗丝308肉鸡18，200只，36日龄，至就诊时已发病5d，共死亡250余只，曾按大肠杆菌病使用抗生素治疗未见效果，甚至死亡加重，遂求诊。
2 临床症状病鸡精神萎靡，卧地不起，羽毛蓬松，排白色或者绿色稀便。
死亡鸡只均体格较大、健硕，死亡快，在网上分布比较集中。
3 病理变化剖检可见死亡鸡只肌肉丰满，胸肌呈现白色棕红色条纹状，气管白色无异常。
腹腔内肝脏肿大，充血，质地变脆；肝颜色浅黄，表面有小米粒大至绿豆大的出血斑坏死灶（图1）。
心包内有黄色积液或呈胶冻样，心肌柔软无力，心尖钝圆（图2、图3）。
肺脏瘀血严重，腺胃肌胃交界处有条纹状出血。
肾脏肿大瘀血有出血斑，花斑肾较轻（图4）。
泄殖腔黏膜出血发红，内有白色绿色稀粪。
4 实验室诊断无菌采集心包积液、肝脏、脾脏、肾脏，分别独立包装，送河北农业大学动物医学院进行PCR检测。
该病例确诊为腺病毒血清4型感染。
4.1 引物设计根据GenBank登录的FAdV-4 （GenBank：GU188428.1） Hexon基因核苷酸序列，设计用于扩增FAdV-4的PCR引物。
鸡安卡拉病毒分离鉴定方法
1 “安卡拉”病毒简介
鸡安卡拉病之所以命名为安卡拉，是因为最早 的文献记载该病的发生地区是位于巴基斯坦卡拉 奇的安卡拉地区，以地名命名病毒和病名，据当时 的报道该病发生于 1987 年的安卡拉地区，发展迅 速，暴发席卷了整个巴基斯坦地区，该病得以引起 人们的重视。此后，该病在全球的养鸡业时有发生， 如 1989 年度墨西哥、1994 年印度德里，此外南美的 智利、西亚的伊拉克等地都曾经大规模暴发该病。 中国在近年来的鸡传染病中也发现了该病的流行， 鸡安卡拉病是一种易感、难防的重要传染病，严重 威胁养殖企业[1]。
养殖与饲料 2018 年第Байду номын сангаас4 期
疫病防控 窑69窑
鸡安卡拉病毒分离鉴定方法
任 锐 1 高 亮 2 刘沂霖 1 任清丹 3 董美英 1
1.吉林省畜牧兽医科学研究院，长春 130051；2.吉林省动物卫生监督所，长春 130051； 3.吉林省畜牧兽医总站，长春 130051
摘要 本文主要从病原学、发病情况、临床症状和病理剖检变化 4 个方面概述鸡安卡拉病毒，并详细阐述安 卡拉病毒分离鉴定方法，直接免疫荧光抗体试验、双抗体夹心法 ELISA 检测病毒抗原、PCR 检测、动物回归实验 和病毒分离，及时准确掌握临床发病情况，及早发现并采取必要的手段控制传染病的暴发。
5）病毒分离。通过机械解离或消化等方法将组 织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要 的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继 续生长与增殖。将鸡成纤维细胞铺满 70%～80%单 层，吸弃生长液，接种病料上清液，设空白对照、阴 性对照，37 ℃感作 1 h，然后再加含 20 mL 小牛双 抗血清的细胞维持液。继续培养 6 d，期间观察细胞 的生长状况。第 7 天时，将鸡成纤维细胞反复冻融 3 次，5 000 r/min 离心 10 min，存于 -80 ℃冰箱，待 检。
鸡安卡拉病毒病诊断及防治
42鸡安卡拉病毒病诊断及防治湿度也是影响腹泻发病率的重要因素，高湿度有利于病原体的存活与繁殖，根据环境温度高低，选择适当的除湿方法也是尤为必要的。
低温季节可以选用热风机，既保温又除湿。
⑷圈舍空气质量：做好保温的同时，也要做好通风工作，通风不良会导致圈舍内氨气等有害气体浓度过高，也会引起仔猪发生腹泻。
⑸加强生物安全措施：养殖场要杜绝与生产无关的人和事物进出，对于进出养殖场的人员、物资、车辆要做好隔离与消毒处理，防止病原从场外传入。
近年来，安卡拉病毒病在我国发病率逐年上升，蛋鸡、麻鸡、黄羽肉鸡、白羽肉鸡以及地方性柴鸡均可感染。
安卡拉病毒病发病通常比较突然，会造成很大经济损失。
该病对我国家禽养殖场的生物安全危害越来越严重，因此，广大家禽养殖从业人员及畜牧兽医技术人员要足够重视其诊断工作及防治技术。
一、病原学特征该病是由腺病毒或者腺病毒与其他因子共同作用而引起的一种导致家禽心包积水、肝脏出现病变以及免疫力下降的一种疾病，也被称为心包积水—肝炎症。
该病首次于1987年在土耳其的安卡拉地区爆发，故被命名为安卡拉病，随后伊拉克、印度、俄罗斯等国相继暴发了该病。
安卡拉病毒病在我国呈现地方性流行的特点，近年来由于病毒变异导致其传染性以及毒力增强，进而逐渐广泛流行，我国曾于2012～2014年形成大面积流行，截至2016年全国各地均有该病发生。
二、流行病学特征该病主要侵害3～6周龄的鸡群，发病无季节性，但以夏末秋初多发，多发于817鸡、麻鸡、肉鸡，也可见于肉种鸡和蛋鸡，对于中小型的规模化养鸡场危害尤为严重。
刚开始呈现零星散发、死亡，发病后5～7天是死亡高峰期，呈区域43第6月 上半月刊成片发病、死亡。
病毒可存活于粪便、气管和鼻腔黏膜以及肾脏，因此病毒可经所有排出物传播，粪便中病毒含量最高。
该病的主要传染源为病鸡以及带毒鸡，康复鸡会终生带毒并排毒，是鸡舍内病毒难以净化干净的主要原因。
由于养殖场饲养管理水平不同，该病的病程长短不一，短则一周，长可达到半个月左右，死亡率一般在20%～80%左右。
鸡安卡拉病的鉴别诊断与规范化防控对策
鸡安卡拉病的鉴别诊断与规范化防控对策周典赟（广德市誓节镇人民政府，安徽广德242220）摘要鸡安卡拉病的病原菌为腺病毒，发病后的特点为传播快速、病程急、发病率高，在各地均可发生流行，病鸡死亡率可达70％以上，对禽类养殖业带来了较大的损失。
本文结合广德县誓节镇实际，对鸡安卡拉病的病原菌及传播方式、发病机理、临床表现、鉴别诊断等进行了总结，并提出了规范化预防及治疗的对策，以期为鸡养殖业的健康发展提供技术指导。
关键词鸡安卡拉病；传播方式；临床表现；鉴别诊断；规范化防控中图分类号S858.31；S855.3文献标识码A文章编号1007-5739（2024）04-0143-03DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2024.04.036开放科学（资源服务）标识码（OSID）：鸡安卡拉病又称鸡心包积水综合征，由腺病毒感染而发病，临床上感染后一般病情急、死亡率高，以3~6日龄的肉鸡发生概率大，后备母鸡、蛋鸡发生概率极低[1]。
鸡安卡拉病在世界各国广泛流行，在20世纪80年代的中东地区最早报道，2000年之后传入我国，之后逐渐蔓延到全国各地，很大程度上阻碍了我国鸡养殖业的健康发展[2]。
誓节镇为皖南地区家禽养殖大镇之一，2023年全镇家禽现有存栏量50.46万只，其中鸡存栏量27.55万只，有规模养鸡场13家，目前养鸡产业已经成为该地区经济发展、农户增收的有效途径。
然而，近年来誓节镇鸡安卡拉病频繁发生，直接导致农户收入下降，影响了其养殖积极性[3]。
本文对鸡安卡拉病的鉴别诊断、规范化防控等进行了总结，以期为该病的防治提供借鉴。
1病原菌及传播方式鸡安卡拉病的病原菌主要是血清4型腺病毒，血清8型、血清11型和传染性贫血病毒引发的病症也与该病相似。
通过电子显微镜，可见到腺病毒的形状为典型的六角形，对氯仿、乙醚等脂溶性溶剂表现出敏感，可耐受一定的高温条件。
鸡安卡拉病的病原菌主要侵染未成年鸡（尤其是3~6日龄的鸡），一般感染后20~30d症状最严重，发病重的鸡只死亡率可超过70％，采取较高管理水平及合理控制措施的养殖场病鸡死亡率低于30％。
鸡安卡拉病的诊断与治疗
山东畜牧兽医 2019年第40卷78 血丝的粘液或渗出物。
各种年龄、各种品种的鸡都易感染，传播迅速，发病率高，死亡快，一旦发病会给养鸡户造成很大的经济损失。
笔者就一起35d 草鸡感染传喉病毒的案例，从发病情况、临床症状、剖检变化、诊断以及防治措施汇报如下，以供同行参考。
1 发病情况2018年秋末冬初时，气温逐渐变冷，当地养鸡户崔某，饲养草鸡1500只，日龄35d ，初期甩头，咳嗽，继而呼吸困难，有时咳出带血丝的粘液，食欲降低，被毛粗乱。
用上呼吸道药物治疗3d 无效，每天都病鸡死亡，来本处就诊。
2 临床症状鸡群食欲降低，每天的饲料量减少，个别鸡精神沉郁，被毛松乱，甩头、肿眼、流泪、咳嗽，有的呼吸困难，有的咳出带血丝的粘液，血丝都甩到鸡笼上，特别是晚上，鸡舍内有拉锯的声音。
3 剖检变化户主带来一只活鸡，一只死鸡。
活鸡剖检：气管环状出血，特别是喉头出血严重，其它器官基本正常，没有病变表现。
死鸡剖检：喉头、气管出血，气管内有条状出血渗出物，肺、气囊、心脏、肝、肾等基本正常。
取样送实验室做进一步确诊。
4 诊断根据发表情况、临床症状、病理剖检，初步怀疑感染鸡传喉病毒。
实验室利用所送病料，进行PCR 检测，显示阳性。
确诊为传染性喉气管炎病。
5 防治措施5.1 隔离 把病鸡捡出，单独饲养，搞好环境卫生，适量通风换气。
5.2 紧急接种 全群用2倍量的传炎性喉气管炎疫苗—涂肛—紧急接种，或者用1.5倍量+青霉素(1只鸡1万IU)点眼紧急接种，同时用泰妙+电解多维，预防继发性感染，免疫24h 以后，再加板清颗粒或者黄芪多糖，连喂4d 。
个别病鸡一边饲喂泰妙+板清颗粒，再用泰乐菌素4g+黄芪多糖20ml+汽水30ml ，肌肉注射100只，1次/d ，连用3d 。
5.3 消毒 鸡舍外周围大面积消毒：用0.5%的戊二醛喷雾消毒，防止其它病毒、细菌的传播和感染；紧急接种后2~3d 全群用0.3%聚维酮碘带鸡气雾消毒。
鸡安卡拉病的鉴别诊断和预防措施
鸡安卡拉病由腺病毒感染所引起，一旦暴发将会对养鸡场带来相当严重的损失。
在文中对鸡安卡拉病的鉴别诊断进行了分析，并就如何预防进行了探讨。
鸡安卡拉病是一种腺病毒感染引起的疾病，由于其最显著的剖检病变是心包积液，所以又称“心包积水综合征”。
近年来，鸡安卡拉病发病率呈上升趋势，给很多养鸡场带来严重损失。
01疾病简述1987年3月，该病首次在巴基斯坦的安卡拉地区被发现，故得名“安卡拉病”，目前，本病南北方均有流行趋势，安卡拉在各种品种的鸡群中发病率都很高，常呈现小范围流行。
02流行病学腺病毒广泛存在于家禽或者野生禽类，一般不表现出症状，但当鸡群抵抗力低，又存在外界诱因的情况下会诱发疾病的发生。
鸡安卡拉病的病程一般为1～2周，死亡率从开始到结束，常成倍数增长，防控不及时会超过90%。
鸡感染后可终身带毒，本病可垂直传播，也可水平传播。
03临床症状与剖检病变该病潜伏期比较短、发病突然，死亡通常在数小时内，死鸡多为体况看似较好的鸡。
患病鸡初期无明显先兆而突然倒地，沉郁，部分出现呼吸道症状（如：甩鼻、呼吸加快，啰音等），排黄色或黄绿色稀粪，临死前出现神经症状，两腿划空，数分钟内死亡。
安卡拉病毒主要侵害心脏、肝脏、脾脏、肾脏。
剖检可见病鸡心肌柔软，心包积有淡黄色渗出液。
肺水肿甚至个别出现淤血、肝脏肿大、边缘钝圆、质地变脆，色泽变黄，并出现坏死。
肾肿大，脾脏轻微肿大。
04临床诊断根据本病流行特点、临床症状、病例剖检变化可初步诊断，若要确诊须进行实验室检测。
05鉴别诊断要点安卡拉病与包涵体肝炎、贫血综合征和氨气中毒很相似，应在临床诊断中加以区别：包涵体肝炎相似点：肝肿胀，呈黄褐色，边缘钝圆，脂肪变性，质地脆弱，肝被膜下有较大面积淤血和出血灶，出血点或出现斑常呈线状或芒状。
脾脏肿大，常见有灰白色斑点；肾脏肿大、苍白，表面有出血点。
不同点：严重贫血，黄疸，肝脏有较明显的灰黄色坏死灶，病鸡皮下、胸肌和腿肌严重出血。
贫血综合症相似点：肉髯、皮肤和可视黏膜苍白，肝、脾、肾均肿胀，肝脏表面有灰白色坏死灶，胸肌和骨骼肌、腺胃黏膜也有出血点。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910121098.9
(22)申请日 2019.02.19
(71)申请人 珠海出入境检验检疫局检验检疫技
术中心
地址 519000 广东省珠海市香洲区九洲大
道东1144号
(72)发明人 赵福振 苏惠龙 李儒曙 邵建宏
罗宝正 廖秀云 沙才华 陈轩
薄清如
(74)专利代理机构 重庆市信立达专利代理事务
所(普通合伙) 50230
代理人 包晓静
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
(54)发明名称
一种鸡安卡拉病检测方法
(57)摘要
本发明属于禽类疾病检测技术领域，公开了
一种鸡安卡拉病检测方法；准备质粒和毒株：提
取样品DNA；设计与合成引物、探针；确定荧光反
应体系和反应程序；取FAdV -4合成质粒稀释浓度
为107作为模板，使用各自的反应体系和反应条
件进行荧光PCR反应检测扩增；对鸡安卡拉病检
测方法进行灵敏度检测和特异性检测。
本发明特
异性强，在对其它血清型的质粒和鸡新城疫、传
染性支气管炎二联活疫苗cDNA产物进行扩增后，
未出现扩增曲线或条带；灵敏度高，荧光PCR可做
到101拷贝的数量级；稳定性强；TaqMan方法配套
扩增试剂便宜且方法成熟，接受程度高，可满足
检测要求，
适用于鸡中HPS病毒的检测。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图4页CN 109706270 A 2019.05.03
C N 109706270
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109706270 A
1.一种鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述的鸡安卡拉病检测方法包括以下步骤：
步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取RNA并反转录成cDNA；
步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；
步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用Clustal X 进行比对，并通过Primer Express 3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；
步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为107作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；
步骤五：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。
2.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤二中，获得的样品DNA模板的260/280比值1.8～2.0，浓度200～500ng/μL，适合后续的扩增反应。
3.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤三中，合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。
4.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤四中，荧光PCR反应体系：Takara 2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，引物浓度10μmol/L，探针1.0μL，探针浓度10μmol/L，DNA模版2.0μL，补水至25μL。
5.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤四中，荧光PCR反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，于60℃30s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。
6.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤五中，灵敏度检测，具体步骤为：
(1)将FAdV-4合成质粒为阳性标准品；
(2)用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释至101拷贝/μL，对梯度稀释的阳性对照进行荧光PCR反应检测；
(3)对阳性标准品以101为单位进行倍比稀释，将得到的浓度为109至101的9个模板使用步骤后的反应体系和反应条件进行扩增，验证所建立方法的灵敏度。
7.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤五中，特异性检测，具体步骤为：
(1)以FAdV-1、FAdV-2、FAdV-10各一份的Fiber全基因合成质粒；
(2)鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的cDNA；
(3)1份FAdV-4合成质粒为模板，使用步骤四的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增，验证所设计引物探针及所建立方法的特异性。
2。