内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨
芒果苷通过MMP9调控巨噬细胞M2极化对胰腺癌的作用及其机制研究
芒果苷通过MMP9调控巨噬细胞M2极化对胰腺癌的作用及其机制研究崔连鸷赵丹宁①孙洪帅翟悦潘悦②野丽莉（吉林省肿瘤医院检验科，长春 130012）中图分类号R73-3 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）12-2601-05［摘要］目的：探讨芒果苷通过MMP9调控M2型巨噬细胞极化治疗胰腺癌的作用及机制。
方法：在体内水平绘制肿瘤生长曲线，免疫组化染色评价芒果苷对胰腺癌的治疗效果；免疫荧光、ELISA检测芒果苷对胰腺癌中M2型巨噬细胞表达的影响；免疫荧光、ELISA、Western blot及qRT-PCR检测芒果苷对MMP9以及下游M2型巨噬细胞极化相关信号通路表达的影响。
在体外水平利用MTT检测M2型极化巨噬细胞对胰腺癌的作用及芒果苷对胰腺癌的治疗效果；ELISA检测芒果苷对M2型极化巨噬细胞的影响；免疫荧光及Western blot检测芒果苷对MMP9及下游M2巨噬细胞极化相关信号通路表达的影响。
结果：小鼠胰腺癌模型中，芒果苷可抑制胰腺癌生长，且可抑制胰腺癌中M2极化巨噬细胞表达；同时芒果苷可抑制胰腺癌中MMP9及下游M2巨噬细胞极化相关信号通路表达。
在M2型极化巨噬细胞-胰腺癌细胞共培养模型中，芒果苷抑制胰腺癌细胞增殖，抑制巨噬细胞M2型极化，同时抑制MMP9及下游M2巨噬细胞极化相关信号通路表达。
结论：芒果苷可通过抑制MMP9及下游M2巨噬细胞极化相关信号通路抑制巨噬细胞M2极化治疗胰腺癌。
［关键词］胰腺癌；芒果苷；巨噬细胞；M2型极化；MMP9Research on effect and mechanism of mangiferin on pancreatic cancer by regulating MMP9-mediated macrophage M2 polarizationCUI Lianzhi， ZHAO Danning， SUN Hongshuai， ZHAI Yue， PAN Yue， YE Lili. Clinical Laboratory， Jilin Cancer Hospital， Changchun 130012， China［Abstract］Objective：To investigate effect and mechanism of mangiferin on regulation of M2-type macrophage polarization tar⁃geting MMP9 in pancreatic cancer. Methods：In vivo， therapeutic effect of mangiferin on pancreatic cancer was evaluated by drawing tumor growth curves and immunohistochemical staining. M2-type macrophages expression in pancreatic cancer was detected by immu⁃nofluorescence and ELISA. Effects of mangiferin on expression of MMP9 and downstream M2 macrophage polarization-related signaling pathways were detected by immunofluorescence， ELISA， Western blot and qRT-PCR. In vitro， MTT assay was utilized to detect effect of mangiferin on M2-type macrophage and therapeutic effect of mangiferin on pancreatic cancer. ELISA was used to detect effect of mangiferin on M2-type polarized macrophages. Effects of mangiferin on expression of MMP9 and its downstream signalling pathway were detected by immunofluorescence and Western blot. Results：Mangiferin had potential to inhibit growth of pancreatic cancer in mice pancreatic model， and could prevent expression of M2-polarized macrophages in pancreatic cancer in addition. At the same time，mangiferin could inhibit expression of MMP9 and downstream M2 macrophage polarization related signaling pathways in pancreatic cancer. Mangiferin inhibited proliferation of pancreatic cancer cells in a M2 type polarized macrophage-pancreas cancer cell co-culture model， inhibited macrophage M2 polarization， at the same time， expression of MMP9 and downstream M2 macrophage polarization related signaling pathway was inhibited. Conclusion：Mangiferin can inhibit macrophage M2 polarization by inhibiting MMP9 and its downstream signaling pathway， and play a role in pancreatic cancer therapy.［Key words］Pancreatic cancer；Mangiferin；Macrophage；M2 polarization；MMP9胰腺癌作为一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，严重危害人类健康［1］。
从脂肪组织的内分泌功能角度探讨其在慢性阻塞性肺疾病中的作用机制研究
从脂肪组织的内分泌功能角度探讨其在慢性阻塞性肺疾病中的
作用机制研究
王益德;李争;李风森
【期刊名称】《中国全科医学》
【年(卷),期】2023(26)6
【摘要】脂肪组织除了通过其力学特征或机械功能对周边组织器官产生影响以外,还可以凭借非物理性的内分泌功能通过脂肪因子输出信号方式有效地建立起与呼吸系统等远程器官的互作信息网络,进而参与多种肥胖相关疾病的发生与发展。
作为内分泌领域的突破性进展之一,脂肪组织的内分泌功能受到生命科学领域的关注。
近年来,多项流行病调查研究揭示了肥胖是造成慢性阻塞性肺疾病(COPD)等呼吸系统疾病肺功能损害重要的危险因素。
基于此,本文将分别梳理脂联素、瘦素、内脂素等脂肪因子在COPD中的作用机制,从脂肪组织内分泌功能角度为COPD的防治研究提供新思路。
【总页数】6页(P754-759)
【作者】王益德;李争;李风森
【作者单位】新疆医科大学第四临床医学院
【正文语种】中文
【中图分类】R563.9
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四妙勇安汤提取物对脂多糖诱导的巨噬细胞表达ICAM-1和MMP-9的影响_聂波
［2］Chen WY．Exogenous and endogenous hormones and breast cancer ［J］．Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2008，22（4）：573－收稿日期：2013－01－12基金项目：国家十一五科技重大专项－创新药物开发（2009ZX09103－318）作者简介：聂波（1977－），女，山东肥城人，副研究员，博士，研究方向：中医药及复方活性物质筛选与成分分析。
通讯作者：陈立新（1964－），男，河北沧州人，教授，博士，研究方向：中西医结合心血管应用基础研究，E-mail：lxchen2011@hotmail．com。
585．［3］胡翔，陆华．含左、右归丸去势鼠血清对3T3－L1前脂肪细胞芳香化酶的影响［D］．成都：成都中医药大学，2003．［4］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data u-sing reahime quantitative PCR and the2－Ct method［J］．Methods，2001，25（4）：402－408．［5］Moalli PA，Talarico LC，Sung VW，et al．Impact of menopause on olla-gen subtypes in the arcus tend ineous fasciae pelvis［J］．Am J Ob－stet Gynecol，2004，190（3）：620－627．［6］丁竟严．现代病理实验免疫组织化学技术［J］．北京：人民军医出版社，2003：125．四妙勇安汤提取物对脂多糖诱导的巨噬细胞表达ICAM－1和MMP－9的影响聂波1，徐颖1，2，徐冰1，3，朱海燕1，吴圣贤1，谢连娣4，陈立新5（1.北京中医药大学东直门医院，中医内科学教育部暨北京市重点实验室，北京100700；2.牡丹江医学院红旗医院中西医结合科，黑龙江牡丹江157000；3.中国藏学研究中心北京藏医院，北京100029；4.北京中医药大学东方医院心血管内科，北京100078；5.北京中医药大学，北京100029）摘要：目的：探讨四妙勇安汤提取物对脂多糖诱导的巨噬细胞表达ICAM－1和MMP－9的影响，初步探讨四妙勇安汤提取物抗动脉粥样硬化的作用机制。
内脏脂肪素的研究进展
内脏脂肪素的研究进展任海艳;林黎明;张竹强【摘要】@@ 脂肪组织不仅是一个被动的能量储存器官,而且也是一个巨大的内分泌系统,可以分泌多种脂肪细胞因子.内脏脂肪素(visfatin)是新近被发现的主要由内脏脂肪合成的一种脂肪细胞因子,具有类胰岛素样作用,能降低血糖和促进脂肪组织的分化与合成.近年来的许多研究表明,内脏脂肪素与缺氧、易损斑块破裂、内皮功能紊乱、血管增生、炎症和糖脂代谢等密切相关,本文就内脏脂肪素的研究进展予以综述.【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2011(027)002【总页数】3页(P124-126)【作者】任海艳;林黎明;张竹强【作者单位】包头医学院,内蒙古,包头,014060;包头医学院第三附属医院功能科;包头市第四医院神经内科;包头医学院【正文语种】中文脂肪组织不仅是一个被动的能量储存器官，而且也是一个巨大的内分泌系统，可以分泌多种脂肪细胞因子。
内脏脂肪素(visfatin)是新近被发现的主要由内脏脂肪合成的一种脂肪细胞因子，具有类胰岛素样作用，能降低血糖和促进脂肪组织的分化与合成。
近年来的许多研究表明，内脏脂肪素与缺氧、易损斑块破裂、内皮功能紊乱、血管增生、炎症和糖脂代谢等密切相关，本文就内脏脂肪素的研究进展予以综述。
1 内脏脂肪素的概述内脏脂肪素是一种由脂肪组织分泌的蛋白质细胞因子，于2005年由日本科学家Fukuhara等［1］从人和小鼠的内脏脂肪中发现并分离和命名的。
Fukuhara等［1］利用差异显示的方法比较皮下脂肪和内脏脂肪的多种PCR产物时，发现一种在内脏脂肪特异性高表达的物质，序列测定证实其cDNA片段与编码前B细胞集落增强因子(pre－B－cell colony－enhancing factor，PBEF)5'端非编码区的基因序列一致。
以往的研究表明，PBEF主要在骨髓、骨骼肌、肝脏、淋巴细胞及胎膜中表达，是一种促进B细胞发育的细胞因子，分子量为52 kD，在脂肪细胞系3T3－L1的分化过程中，PBEF的基因表达和蛋白合成均增加。
MMP-9和Actin在胃肠道间质瘤中的表达及意义
９ Ａ ｔ 的表达情况。结果：Ｍ Ｐ ９和 Ａ ｔ 在正常 胃肠道组织和 良性 胃肠道 间质瘤 和 ｃｎ ｉ Ｍ 一 ｃｎ ｉ 瘤 细胞 中呈 阳性 表达 ，而在 恶性 胃肠 道 间质 瘤 瘤 细胞 中呈 阴性 表 达 （ ＜ ．５ 。结 论 ： Ｐ ００ ）
消化 道 问叶性肿 瘤 十分少见 。２ 纪 ８ ０世 ０年代 前认 为 ，消化 道 间 叶 性 肿 瘤 主要 是 平 滑肌 源 性 肿 瘤 。但在 ２ 纪 ８ Ｏ世 ０～９ ０年代 初 ，通 过 免 疫 组 织 化 学和 电镜 研究 发 现 ，绝 大部 分 消化 道 间叶 性 肿 瘤并 不一 定 具 有 平 滑 肌 的 电镜 及 免 疫 表 型 特 点 ， 缺 乏特异 性 细胞 分 化 ，于是 提 出 胃肠 道 间质 肿 瘤
５ ）４Ｃ ０ ￣ 冰箱过夜 ，加生物素标记 的二抗和 ｓ Ｐ复
收稿 日期 ： ００—１— ７ ２１ ２ 通讯作者 ：程玲 ，ｇ ｃ ｘ ６ ．ｏ ｌ ｌ ＠１ ３ｃｉ ｑｘ ｎ
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５ ・ ４
九江学院学报 （ 自然科学版 ）
２ｌ Ｏ Ｏ年第 ２期
合物各 ３ ｉ， ０ｒｎ 新鲜配制的 Ｄ Ｂ液显色中性树胶 ａ Ａ 封片 ， 显微镜下观察 。
及良 恶性的诊断，为临床治疗 和评估预后提供有 意义的理论及实验依据。
１材 料与 方法
Ｇｓ ＩＴ的分型 、诊断 并 不 是 主要 问题 ，主要 问题是 良恶 性 的鉴别 。关 于鉴别 ＧＳ 良恶 性 的标 准 ，意 ＩＴ 见 尚不完全统 一 。
１１材 料收 集 ．
九 江 学 院 附 属 医 院 、九 江 市 第 一
巨噬细胞调节脂肪扩张和胰岛素敏感性机制研究
巨噬细胞调节脂肪扩张和胰岛素敏感性机制研究
导读：近日，来自法国的科学家在著名国际学术期刊NatureMedicine在线发表了他们的最新研究进展，他们发现IRF5与肥胖及胰岛素敏感性改变具有相关性，并通过敲除小鼠模型对其在肥胖及代谢……
近日，来自法国的科学家在著名国际学术期刊NatureMedicine在线发表了他们的最新研究进展，他们发现IRF5与肥胖及胰岛素敏感性改变具有相关性，并通过敲除小鼠模型对其在肥胖及代谢中的作用进行了探讨。
内脏脂肪的积累与炎症增加以及代谢性疾病患病风险增加具有重要关联。
但调节脂肪组织病理性扩张的分子机制一直不清楚。
之前有研究表明干扰素调节因子5（IRF5）对于巨噬细胞向促炎症方向极化具有重要调节作用。
在该项研究中，研究人员发现IRF5缺失小鼠在高脂饮食刺激下，与野生型小鼠相比，其内脏脂肪的生长并没有明显变化，但其皮下脂肪组织表现出明显的扩张。
通过对内脏脂肪进行分析，他们发现IRF5缺失小鼠其内脏脂肪中选择性激活的巨噬细胞出现明显的积累，并且高度的胶原沉积限制了脂肪细胞的生长，同时，与野生型小鼠相比，IRF5缺失小鼠的胰岛素敏感性得到了显著改善。
随后，研究人员利用肥胖人群进行了分析，发现IRF5的表达水平与内脏脂肪的胰岛素敏感性和胶原沉积呈负相关。
研究人员对脂肪组织中对巨噬细胞进行了全基因组表达分析，结果表明TGFB1是IRF5的直接靶基因，IRF5能够介导对TGFB1表达的抑制作用。
这项研究揭示了IRF5在调节不同脂肪组织部位生长以及肥胖
过程中胰岛素敏感性方面具有重要作用，抑制IRF5表达可能是促进代谢健康状态，改善肥胖及相关代谢紊乱的一条潜在途径。
内脂素对巨噬细胞凋亡的影响及其机制研究
内脂素对巨噬细胞凋亡的影响及其机制研究张高峰;许澎;乔祺【摘要】目的:探讨内脂素对巨噬细胞凋亡的影响及其机制.方法:血清饥饿法诱导THP-1细胞凋亡,加入不同浓度的内脂素(0～100 ng/mL 5个浓度组),每组分别孵育24～48 h.同时设立2-羟基萘甲基磷酸三乙酸甲基酯(HNMPA)组.用AnnexinV-碘化丙啶流式细胞仪检测及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡情况,并检测caspase-3活性及细胞色素C的释放.结果:内脂素增加THP-1细胞凋亡百分比,呈浓度依赖(P＜0.05)；增加caspase-3活性及细胞色素C的释放(P＜0.05).HNMPA能完全抵消内脂素的促进凋亡作用.结论:内脂素促进巨噬细胞凋亡,凋亡过程涉及增加线粒体内细胞色素C的释放；其机制可能通过胰岛素受体信号途径发挥作用.%Objective:To investigate the effect of visfatin on macrophages apoptosis and possible mechanism. Methods: Apop-tosis was induced in macrophages derived from THP-1 cell line by serum starvation. Visfatin administration enhanced macro-phage apoptosis by means of annexin V binding assay, TUNEL assay and caspase activity in a dose-dependent manner within the range of 12. 5 tolOOng/mL. Results: Visfatin also increased release of cytochrome C. In the exploration of the signaling pathway involved in these pro-apoptotic effects of visfatin, pretreatment of cells with a specific insulin receptor antagonist-HNMPA significantly suppressed visfatin-mediated cell apoptosis and caspase activity in macrophages. Conclusions: Visfatin enhance macrophages apoptosis, and it is mediated through insulin receptor signaling pathway.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2011(018)005【总页数】4页(P617-620)【关键词】内脂素;巨噬细胞;细胞凋亡;动脉粥样硬化【作者】张高峰;许澎;乔祺【作者单位】旦大学附属上海市第五人民医院心内科,上海200240;旦大学附属上海市第五人民医院心内科,上海200240;旦大学附属上海市第五人民医院心内科,上海200240【正文语种】中文【中图分类】Q255动脉粥样硬化是冠心病的病理基础。
糖尿病视网膜病变患者内脂素、抵抗素、瘦素水平与MMP-2和MMP-9的相关性研究
1.1临床资料
根据如下纳入标准和排除标准收集2011年1月至2013年6月来我院就诊的糖尿病及糖尿病视网膜病变患者86例，根据患者病变程度，分为单纯糖尿病组（A组）、非增生型DR组（B组）、增生型DR组（C组）。A组男15例，女16例，年龄51～76岁，平均年龄（65.3±5.7）岁；B组男16例，女14例，年龄51～76岁，平均年龄（65.2±5.6）岁；C组男16例，女9例，年龄51～76岁，平均年龄（65.4±5.8）岁。同期收集来我院体检健康的正常志愿者35例，为D组，男25例，女10例，年龄51～76岁，平均年龄（65.3±5.5）岁。四组患者年龄、性别均无统计学差异，具有可比性。
糖尿病视网膜病变患者内脂素、抵抗素、瘦素水平与MMP-2和MMP-9的相关性研究
摘要】目的：探讨糖尿病视网膜病变患者内脂素、抵抗素、瘦素水平与MMP-2和MMP-9的相关性研究。方法：收集2011年1月至2013年6月来我院就诊的糖尿病及糖尿病视网膜病变患者86例。根据患者病变程度，分为单纯糖尿病组（A组）、非增生型DR组（B组）、增生型DR组（C组），每组分别有31例、30例、25例。同时选择同期行健康体检的健康人群35例为D组。检测各组内脂素、抵抗素、瘦素水平以及MMP-2和MMP-9的水平。结果：B、C组血清内脂素水平略低于A、D组，而抵抗素、瘦素、MMP-2和MMP-9水平高于A、D组，且C组血清内脂素明显低于B组，C组MMP-2和MMP-9水平高于B组，上述差异分别经t检验比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；A、D上述血清水平虽然存在变化差异，但经t检验，无统计学意义(P＞0.05)。内脂素与MMP-2和MMP-9呈负相关（P＜0.05）；抵抗素和瘦素与MMP-2呈正相关（P＜0.05）。结论：脂肪因子紊乱和MMP-2以及MMP-9失调是糖尿病视网膜病变的危险因素，为糖尿病视网膜病变的早期治疗提供了新的思路。
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内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨范虞琪;何奔;王彬尧【摘要】目的研究内脏脂肪素(visfatin)对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用及其机制.方法体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞.为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组:①巨噬细胞+visfatin 12 h组;②巨噬细胞+visfatin 24 h组,两组的visfatin的质量浓度均为:0(对照组)、50、100、200、400 ng/mL.采用RT-PCR和Western blotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性.为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组:①巨噬细胞未加刺激组(对照组);②巨噬细胞+ MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin(200ng/mL)24 h组;④巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)24 h组(Vis200组);⑤巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)刺激不同时间组(5、10、15、30、60 min).Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平.结果 Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时增强了MMP-9的活性(P<0.01).p38 MAPK、ERK1/2 MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作用;visfatin能促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达.结论 Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(029)009【总页数】6页(P1057-1061,1065)【关键词】内脏脂肪素;基质金属蛋白酶;丝裂原活化蛋白激酶;视黄醛X受体;动脉粥样硬化【作者】范虞琪;何奔;王彬尧【作者单位】上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上海,200001;上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上海,200001;上海交通大学,医学院仁济医院心内科,上海,200001【正文语种】中文【中图分类】R543.1;Q786;R-33动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)与肥胖相关性疾病的关系密切。
目前，脂肪细胞分泌因子对于心血管疾病的影响，特别是对AS斑块稳定性的作用正受到高度关注。
内脏脂肪素(visfatin)作为一种新发现的脂肪细胞分泌因子，已经被证实能调节糖代谢和影响内皮功能，并能调控微循环形成[1-2]。
然而，有关visfatin对炎症反应的影响报道很少。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是影响AS斑块稳定性的重要因子。
在AS斑块炎症入侵部位，巨噬细胞分泌大量MMPs，加剧了炎症反应和斑块的不稳定性，而MMP-9是MMPs家族中导致斑块破裂的最主要因素。
近年来研究发现，巨噬细胞是AS斑块处MMP-9的主要来源。
因此，本研究探讨了visfatin对巨噬细胞炎症因子MMP-9的作用及其机制，旨在为AS的预防和治疗提供新的思路。
1 材料与方法1.1 材料人单核细胞株THP-1细胞(中国科学院上海细胞所)；RPMI-1640培养基(Gibco)；胎牛血清(四季清公司)；visfatin(Axxora)；RT试剂盒(Qiagen)；佛波醇(Calbiochem)；TRIzol(Invitrogen)；Taq酶(New England Biolabs)；BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)；p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)抑制剂SB203580(SB)、ERK1/2 MAPK抑制剂PD98059(PD)、JNK MAPK抑制剂SP600125(SP)、视黄醛X受体(retinoid X receptor，RXR)天然配体9-顺式维甲酸(9-cis RA)(Sigma)；过氧化物酶体增殖剂活化受体(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)配体Pioglitazone(piog)和15d-PGJ2(PGJ2)(Cayman Chemical)；β-actin兔抗人单克隆抗体(Abcam)；PPARγ鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz)；p38 MAPK、P-p38 MAPK、ERK1/2、P-ERK1/2 MAPK、JNK MAPK、P-JNK MAPK兔抗人单克隆抗体(Cell Signaling Technology)；MMP-9兔抗人单克隆抗体(Abcam)；红外标记羊抗兔多克隆抗体(Abcam)。
1.2 方法1.2.1 细胞诱导和分组：THP-1细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。
按1×106 /孔的细胞密度，将细胞转入六孔板；在培养液中加入100 nmol/L 的佛波醇刺激48 h，使悬浮细胞分化为贴壁生长的巨噬细胞。
PBS清洗3次，更换无血清的RPMI-1640继续培养。
为明确visfatin对MMP-9的作用，分为两组：①巨噬细胞+visfatin 12 h组；②巨噬细胞+visfatin 24 h组，两组的visfatin的质量浓度均为：0(对照组)、50、100、200、400 ng/mL。
为明确visfatin对MMP-9的作用机制，细胞分为五组：①巨噬细胞未加刺激组(对照组)；②巨噬细胞+MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin(200ng/mL)24 h组；③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组；④巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)24 h 组(Vis200)；⑤巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)刺激不同时间组(5、10、15、30、60 min)。
MTT法估算细胞活力，干预前后细胞存活率>95%。
1.2.2 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达：按TRIzol使用说明提取RNA。
取2 μg总RNA，用Oligo-dT37℃孵育60 min反转录合成cDNA，并合成以下引物(上海生工生物技术公司)：MMP-9(115 bp)上游引物：5’-ACTACTGTGCCTTIGAGTCC-3’，下游引物：5’-AGAATCGCCAGTACTTCCC-3’； GAPDH(208 bp)上游引物：5’-AACGGATTTGGTCGTAG-3’，下游引物：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。
按以下条件行PCR反应：95℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s， 25个循环；72℃延伸5 min。
采用1.0%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，检测净光密度，以GAPDH mRNA表达量为内参，以同组细胞MMP-9 mRNA表达量和GAPDH mRNA表达量的比值进行半定量分析。
1.2.3 Western blotting检测MMP-9蛋白、PPARγ蛋白表达及p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平：4℃细胞裂解液裂解细胞收取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。
25 μg蛋白样品与上样缓冲液混合后变性，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
室温下100 V×90 min湿转法转膜，5%牛奶室温封闭1 h。
结合I抗室温2 h，结合Ⅱ抗室温1 h。
洗膜、蛋白条带扫描(Odyssey)后定量分析。
1.2.4 明胶酶谱法检测MMP-9活性：巨噬细胞经vsifatin刺激24 h后收集细胞培养上清液。
BCA法测量蛋白后调节上样蛋白量。
10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(含0.1%明胶)垂直电泳，100 V×150 min。
室温下，凝胶置于复性缓冲液(25%Triton X-100)中复性30 min。
换用孵育液(50mmol/L Tris、0.2 mol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.02% Brij 35)37℃孵育12 h。
使用0.5% (w/v)考马斯亮蓝R-250染色30 min，考马斯亮蓝R-250褪色液脱色。
对降解带进行拍照，光密度扫描分析。
1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，所有数据用表示，组间比较采用t检验。
P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果2.1 Visfatin对MMP-9的作用2.1.1 Visfatin对巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响：在巨噬细胞+visfatin 12 h组，100 ng/mL visfatin即可促进MMP-9 mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；当visfatin质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9 mRNA表达较对照组上升1.8倍(P<0.01)。
在巨噬细胞+visfatin 24 h组，50 ng/mL visfatin即可使MMP-9 mRNA表达较对照组上升1.26倍(P<0.05)；当visfatin质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9 mRNA表达上升2.4倍(P<0.01)(图1)。
可见，visfatin呈时间依赖性和剂量依赖性促进巨噬细胞MMP-9 mRNA的表达。
2.1.2 Visfatin对巨噬细胞MMP-9蛋白表达的影响(图2)：在巨噬细胞+visfatin 12 h组和巨噬细胞+visfatin 24 h组，50 ng/mL visfatin即可促进MMP-9蛋白的表达(P<0.05和P<0.01)；当visfatin的质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9蛋白表达较对照组上升3.7倍和5.3倍(P<0.01)(图2)。
可见，visfatin呈时间依赖性和剂量依赖性促进巨噬细胞MMP-9蛋白的表达。
2.1.3 Visfatin对MMP-9基质降解作用的影响：在巨噬细胞+visfatin 12 h组，100 ng/mL visfatin即可促进MMP-9的基质降解作用(P<0.01)；当visfatin的质量浓度达到400 ng/mL时，MMP-9的基质降解作用较对照组上升5.2倍(P<0.01)。