酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
肝纤维化标志物的检验
肝纤维化标志物的检验肝纤维化又称肝硬化是一种常见的慢性进行性疾病。
病理组织学上是由肝实质细胞变性坏死、间质结缔组织增生、肝细胞结节状再生、肥大等三者穿插混合而成的病理变化。
随病情发展，使肝脏小叶正常结构逐渐被改建的假小叶和肝细胞再生结节取代，肝脏终于萎缩改变。
肝纤维化的标志物通常用于判定肝内纤维组织形成的活跃状态和程度，主要有下列方法：①形态学方法，通过肝穿组织病理学检查而定；②组织生化法，用生化法测定肝组织中脯氨酰羟化酶，此酶参与不溶性胶原的形成，在酒精性肝病中随病情进展而增高；③血清中羟脯氨酸、脯氨酰羟化酶、N-乙酰-β-葡萄糖胺酶（NAG）及Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）等测定，目前认为PⅢP最有意义。
迄今为止，常规肝功能试验尚无法诊断肝纤维化或早期肝硬化。
蛋白电泳上β-γ桥的出现对肝硬化具有特异性，但仅于肝硬化后期，且主要为酒精性肝硬化。
肝纤维化的实质是细胞外间质的结缔组织增生，其成分主要为胶原蛋白，还有各种糖蛋白和蛋白多糖等，测定血清中这些成分和其降解产物，以及参加代谢的酶有助于诊断肝纤维化。
（一）胶原及其代谢产物的测定胶原类型多种，目前认为在肝内至少有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型，以Ⅰ和Ⅲ型为多。
早期肝硬化以Ⅲ型胶原增多为主；晚期以Ⅰ型为主。
血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，即层板素）等非胶原蛋白，在肝炎后肝硬化及慢性肝血清中亦明显升高。
血清Ⅲ型前胶原氨基端肽（PⅢP）是前胶原Ⅲ（PCⅢ）在氨基肽酶作用下的水解产物，其含量能反映Ⅲ型胶原的代谢情况，可作为早期肝纤维化的一种检验指标，但其在CPH、CAH、PBC及血色素病、酒精性肝病及其他各种肝病中均有增加。
（1）测定：多用放射免疫分析法，参考值为8.9±2.0μg/L。
（2）临床价值1）测定PⅢP不仅可帮助早期诊断肝硬化，并能无损伤地观察病程演变过程，可靠地反映肝纤维化的活动性和程度，有助于判定慢性肝病的预后及观察抗纤维化药物的疗效。
肝星状细胞详解
肝星状细胞肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。
HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。
在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。
中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科简介肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。
肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。
当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。
激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
背景早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。
1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。
因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。
这种观点在当时得到了广泛的认同。
直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。
1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不是肝内的巨噬细胞。
肝纤维化讲解
ECM旳构成及主要功能
构成：蛋白质（胶原、弹力纤维）、糖蛋白 及蛋白多糖
功能：
1、支撑及维持组织构造、形态与修复 2、细胞接触面及半选择性弥散屏障 3、调整细胞分化、增殖、移行及信息传递 4、参加调整微循环、代谢及免疫反应
ECM 旳胶原蛋白质
间质性胶原（纤维形成胶原）： I、III型：为肝内主要胶原成份，各占33%，I / III百分比为1:1；
非创伤性诊疗 创伤性诊疗
组织病理学诊疗
肝活检标本组织学检验是纤维化诊疗旳金原则 常规组织形态学评估 特殊旳组织学检验 肝纤维化组织学半定量评估系统 计算机图像分析系统
几种肝纤维化分期半定量评估系统
评分 Knodell
Ishak
Scheuer
0
无纤维化
无纤维化
无纤维化
1
汇管区扩大 有些PF±短纤维隔
V型：分布于血窦周围和门脉区，作为关键使I、III型胶原形 成粗大旳纤维；
VI型：分布于I、III、V型胶原形成旳纤维素之间起粘附作用； 基底膜胶原（非纤维形成胶原）：
IV型：主要分布于肝血窦内皮下，是肝细胞和内皮细胞功 能性基底膜旳主要成份；
ECM 旳非胶原糖蛋白
纤维连接素（FN)：在肝纤维化早期时增多，作为后来胶原 沉积旳支架；
TGFß1在肝纤维化形成所起旳中心作用
刺激ECM合成 增长I、III、IV型胶原、 FN 诱致HSC合成胶原 调整细胞增生 克制HSC增生，但刺激其转化
克制基质降解 降低MMPS合成 增长TIMPS旳合成并调整本身活性型旳变化
受体体现增强 TGFβ辅助受体合成↑
刺激其他生长因子受体（PDGF、TGFα）体现↑及整合素家族受体↑
参加肝纤维化旳细胞成份
肝纤维化的分子机制及治疗方法研究
胞生长 因子 信号通路激活 内源性 Ｐ Ｐ Ａ Ｒ 一＾ ｙ基 因表达 ，进而抑制 ｄ— Ｓ ＭＡ、Ｔ Ｇ Ｆ —Ｂ 和 ＭＣ Ｐ — ｌ 的表达起抗纤维化 的作用 。 尽 管有大量 的药物 有抗纤维 化的作 用 ，但它们 有各 自的局 限和副作用 。因此 ，寻找 能够起 到抗 肝纤 维化作用 且副作 用较
骨髓 来源 细胞和上 皮 间充 质组织 的异常堆 积 ，均可使 肝脏细 胞 模 ，使用单 克隆抗体免疫组织化学染色 ，结果显示 Ｎ 一二 甲基亚 外 基质增 加 ，而胶 原降解 下降 。从 长远来看 ，其可 能导致肝 硬
化及 相关并发症 ，也可 能有 致癌作用 ，引起肝脏 正常功能丧失 ， 最终导致 死亡 ｌ １ ］ 。本 文综述 了关 于肝纤 维化 的分子机 制及其 对 某些生化 指标 的影响 和抗 纤维化 物质 的研 究 ，以讨 论阻止 或逆
的研究结果显示存在大量 的植物衍生物可 阻止甚 至逆转肝纤维 化的过程 ， 具 体有 效地阻止或逆转肝纤维化的策略将成为未来研究 的重点 。
【 关键词 】 肝纤维化 ； 生化异 常； 基 因疗法 ； 抗纤 维化 策略
中图分类号 Ｒ ５ ７ ５ 文献标 识码 Ａ 文章编号 １ ６ ７ ４ — ６ ８ ０ ５ （ ２ ０ １ ４ ） ６ — ０ １ ６ ２ — ０ ３
综
述 Ｚ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｕ 《 中 外医 学 研究》 第１ ２ 卷 第６ 期（ 总 第２ ３ ０ ） ２ ０ １ ４ ２ 月
肝 纤维化 的分子机 制及治疗方 法研 究
孙 吉① 李静静②
【 摘要 】 肝纤维 化是 一个渐进性过程 ，由纤 维结 缔组织过度增殖和积 聚形 成。肝纤维化过程异 常复杂 ，了解其分子机制就 显得 尤为重要 引起肝脏 内结缔 组织增 生 出现异
肝星状细胞与肝纤维化关系研究进展
肝星状细胞与肝纤维化关系研究进展李伟琴;徐光华;袁致海【摘要】在世界范围内,有数千万肝纤维化患者,这些患者可能最终发展为肝硬化,肝衰竭而死亡。
虽然在此领域的研究已经取得了长足的进展,但是由于肝纤维化的发生机制的复杂性,仍然没有十分有效的治疗办法。
现在越来越多的临床及实验证明,肝纤维化是可以逆转的,在Safad i等[1]研究中亦表明:肝纤维化在去除损伤因素后尚有逆转的可能。
肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化形成的中心环节,HSC在肝纤维化形成,及逆转过程的作用也成为研究热点之一。
目前[2]认为激活的HSC有两个去向:(1)由激活态转变回静止态;(2)发生凋亡而死亡。
且大多数研究表明,活化的HSC主要通过凋亡途径消除,是纤维化消退的主要机制。
这也就使HSC与肝纤维化的发生机制与治疗方面有密切关系。
1 HSCHSC是1996年为纪念德国学者Kuffer的贡献采用了Sterzellen的英译名Stellate cells(星状细胞)而得名[3]。
该细胞又名贮脂细胞,Ito细胞,窦周细胞等,位于肝内窦周间隙,既D isse腔隙,约占肝内细胞总数的5%~15%,其分布广泛,形态不规则,常伸出数个星状突起,胞质内有1~14个直径约2·0...【期刊名称】《延安大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2009(007)001【总页数】3页(P7-9)【作者】李伟琴;徐光华;袁致海【作者单位】延安大学附属医院感染科,陕西,延安,716000;延安大学附属医院感染科,陕西,延安,716000;长安友谊医院,陕西,长安,710118【正文语种】中文【中图分类】R5在世界范围内，有数千万肝纤维化患者，这些患者可能最终发展为肝硬化，肝衰竭而死亡。
虽然在此领域的研究已经取得了长足的进展，但是由于肝纤维化的发生机制的复杂性，仍然没有十分有效的治疗办法。
现在越来越多的临床及实验证明，肝纤维化是可以逆转的，在 Safadi等［1］研究中亦表明：肝纤维化在去除损伤因素后尚有逆转的可能。
肝星状细胞与肝纤维化
肝星状细胞与肝纤维化唐桂连【摘要】肝纤维化是各种慢性肝病共有的病理改变,逆转肝纤维化可阻止大多数慢性肝病进展.肝星状细胞(HSC)是肝内一种具有多功能、变化不定的非实质细胞,HSC活化是肝纤维化发生的中心环节.阐明其关系,有助于以HSC为靶点的肝纤维化方面的研究.【期刊名称】《国际消化病杂志》【年(卷),期】2012(032)005【总页数】4页(P270-273)【关键词】肝星状细胞;活化;肝纤维化【作者】唐桂连【作者单位】524008,广东海洋大学医院【正文语种】中文肝纤维化是肝脏对慢性损伤的修复反应，是各种慢性肝病共有的病理改变，以胶原等细胞外基质(ECM)在肝脏过度沉积为特征，属可逆病变。
晚期肝纤维化可导致肝硬化、门脉高压和肝功能衰竭[1]。
研究证实，HSC是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞是肝纤维化(HF)发生、发展的核心环节。
各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展[2]。
现就HSC与HF的关系作一综述。
1 肝纤维化的发生与逆转肝纤维化的发生与逆转主要是ECM的产生、堆积及降解的过程。
在正常的肝脏中存在一层薄的、低密度的基底膜，在肝纤维化的发生过程中，一系列的酶，包括锌依赖的基质金属蛋白酶(MMP)与其抑制因子(TIMP)和一些逆转酶发生数量及功能的改变，导致ECM的数量及构成发生变化，正常的降解过程受到抑制，最终导致过多的不溶性基质堆积在肝脏中，引起肝脏发生结构的改变，并引起相应的功能异常，在失去肝脏自身代偿的情况下，形成肝纤维化甚至肝硬化。
HSC是肝损伤时生成细胞外基质的主要细胞来源，在20世纪80年代作为产生细胞外基质的主细胞并命名。
在四氯化碳(CCl4)、铁负荷及胆道阻塞诱导的肝纤维化模型中都得到了相似的证据，即HSC作为产生ECM的主要细胞在肝纤维化发生、发展中的机制中发挥了重要作用。
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酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生
【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.
【期刊名称】《泰山医学院学报》
【年(卷),期】2010(031)007
【总页数】2页(P513-514)
【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法
【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生
【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016
【正文语种】中文
【中图分类】R282.71
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修
复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。
近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。
为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产
品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。
其余试剂均为分析纯。
1.2 试剂配制 1%明胶：称 1.0 g明胶溶于 100 ml蒸馏水,37℃溶解,4℃保存。
样品缓冲液：0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),10%SDS,4%蔗糖,0.1%溴酚蓝。
电泳缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸(pH 8.5),0.1%SDS。
洗脱缓冲液：
2.5%Triton X-100。
明胶酶缓冲液：50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2。
染色液：0.25%考马斯亮蓝 R-250(溶于 1︰4.5︰ 4.5的冰乙酸、甲醇和 H2 O中)。
脱色液：冰乙酸︰甲醇︰ H2O=1︰ 4.5︰4.5。
1.3 细胞培养 HSC细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心细胞库,生长于 DMEM培养基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)+15%胎牛血清(含 2 mM L-glutamine,penicillin and streptomycin)中 ,置37°C(5%CO2 ～ 95%air)培养箱生长,以0.05%EDTA-PBS分散成为单细胞。
取处于对数生长期的细胞用于实验。
1.4 明胶酶的酶谱法测定
1.4.1 制胶与普通的聚丙烯酰胺凝胶的制胶过程相同,只在分离胶中加入 1%的明胶,使明胶的终浓度为 0.1%。
1.4.2 样品制备 HSC培养 24 h后的细胞培养基离心后以 2︰ 1与样品缓冲液混匀,取15μl上样电泳。
1.4.3 电泳于 BIO-RAD电泳槽中,常温 80 V电压电泳 30 min,100 V电压电泳1.5 h。
1.4.4 洗脱将胶置于洗脱缓冲液中,脱色摇床上洗脱 15 min,蒸馏水中漂洗 3次,充分除去 SDS。
1.4.5 反应将胶置于反应缓冲液中37℃反应过夜。
1.4.6 染色及脱色将胶自反应液中取出,三蒸水漂洗 2次,染色液中常温染色 4 h,蒸馏水漂洗 2次,置脱色液中常温脱色 15 min,照相、记录。
2 结果
2.1 培养的 HSC 图 1显示培养 10d的 HSC,细胞呈星形、多边形、棱形,有很长的细胞突起。
细胞复苏以后传代培养,此时的 HSC是研究 ECM合成与降解的良好材料。
图1 培养 10d的HSC(×400)
2.2 酶谱法检测到的 MMPs活性条带此方法能够灵敏地检测到 HSC分泌到细胞外的 MM--2和MMP-9,并且 MMP-2的活性高于 MMP-9(图 2)。
当A3处理
24h以后,培养基中的 MMPs活性发生了改变,培养基中检测到 MMP-9和 MMP-2并且 MMP-2活性增加(图 3)。
图2 酶谱法检测到MMPs
图3 A3处理 24h后 MMPs活性
3 讨论
肝纤维化是肝脏 ECM合成与分解代谢失衡所造成的不良结局,是临床上常见的病理生理改变。
HSC在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,既参与 ECM合成,也
调节其降解,是造成 ECM在细胞外过度堆积的重要原因。
酶谱法为研究 HSC MMPs基因表达差异,内源及外源性激活条件,酶活性的调节,从而研究肝纤维化的
病理生理机制和研究具有促进肝纤维化过程中ECM降解的药物和方法有重要意义。
用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,能够检测到 HSC细胞内和培养基中的 MMP-2和 MMP-9,并且培养基中 MMP-2活性高于MMP-9,这与文献报道
的 HSC较高的表达 MMP-2 mRNA相一致[3]。
当药物作用后,培养基中 MMP-2
显著增加,表明 MMPs的表达发生了改变,或者酶被激活。
目前,常用于检测 MMPs 的方法主要是ELISA和放免法,这些方法只能检测其含量,不能检测其活性。
而MMPs活性受到 TIMPs调节,TIMPs通过与 MMPs非共价结合,从而抑制 MMPs
的活性和 ECM降解,MMPs的数量不反应其对 ECM的降解能力,因此,测定 MMPs 活性更有意义[4]。
酶谱法不影响 TIMPs与 MMPs的结合,能够测定 MMPs的活性,反映其在 ECM降解过程中的作用,并且此方法经济、简便、重复性好。
参考文献：
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[2] 赵稳兴,.梁崇礼.酶谱法测定肝星状细胞合成的基质金属蛋白酶活性[J].中国应用生理学杂志,2002,18(2)：56-58.
[3] Lichtinghagen R,Breitenstein K,Arndt B,et parison of matrix metalloproteinase expression in normal and cirrhotic human
liver[J].Virchows Arch,1998,432：153-158.
[4] Herron GS,Banda MJ,Clart E J,et al.Secretions of metelloproteinase by
stimulated capillary endothelial cells[J].JBiol Chem,1986,261：2814-2818.。