明胶酶谱法
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
明胶酶检测方法研究进展_陈秋凤
明胶酶检测方法研究进展陈秋凤1，周防震21．湖北民族学院附属医院（湖北恩施445000）2．湖北民族学院生物科学与技术学院（湖北恩施445000）【关键词】明胶酶；检测方法；进展【中图分类号】R739．87【文献标识码】A【文章编号】1008－8164（2012）01－0070－02明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶［1］、基底膜性胶原酶［2］等，属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloprotein-ases，MMPs）范畴，包括明胶酶A（MMP－2或称72kDaⅣ型胶原酶）和明胶酶B（MMP－9或称92kDa Ⅳ型胶原酶），可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症［3］、纤维化［4，5］、免疫［6］与肿瘤转移［7 9］等诸多过程中发挥重要作用。
明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA 法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。
本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。
1基于明胶酶催化活性的检测方法利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法（Zymography）、荧光明胶酶法和DQ明胶（Dye－quenched－gelatin）原位酶谱法。
1．1明胶酶谱法Kleiner等［10］于1994建立此方法，是一种基于非还原SDS－PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法。
主要原理是：1）含明胶酶的样本首先上样进行非还原SDS－PAGE电泳，利用明胶酶与阴离子去垢剂SDS结合，形成蛋白质－SDS 复合物，使待测蛋白质带上相同的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量大小；2）SDS－PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂（Triton－x100）的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10kDa的小肽，转变为有活性的酶［11］，降解凝胶中相应部位的明胶。
明胶酶谱法 -回复
明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。
明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。
这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。
明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。
在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。
明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。
这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。
明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。
这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。
明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。
在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。
明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。
明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。
明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。
在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。
明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。
明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。
这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。
明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。
该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。
明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。
酶谱法检测金属蛋白酶活性
原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
2试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O 4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/l Tris（PH 8.8）2.5ml10% SDS 100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED 8ul1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O 4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml10% SDS 60ul10%过硫酸铵60ulTEMED 6ul（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2 ml溴酚蓝0.024gddH2O 2.4ml(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/LCaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）3实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
明胶酶谱法
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
改良明胶酶谱测定明胶酶活性
·简 报·改良明胶酶谱测定明胶酶活性①710032 西安 第四军医大学细胞工程研究中心 骞爱荣 商 澎 陈志南②关键词 明胶酶谱;基质金属蛋白酶;电泳;聚丙烯酰胺凝胶中图分类号 R965.2 基质金属蛋白酶(M MPs)是能降解细胞外基质和基底膜成分的酶家族成员之一。
这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和膜型基质金属蛋白酶(M T-M MP)等5大类。
MMPs家族成员目前已鉴定出28种[1]。
M MP的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关,如肿瘤转移、血管浸润、骨质疏松、组织纤维化等,尤其是明胶酶A和B(MMP-2,9)在肿瘤的转移和血管生成方面起重要的作用[2]。
目前,测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog-raphy),即收集待测样本,处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行SDS-PAGE。
但是,传统的方法样品处理费时、费事。
因此,从方法学的角度,寻找简便实用的检测MM Ps活性的方法有重要的意义。
本文介绍一种改良的明胶酶谱方法,较好地解决了实验中遇到的一些难题,且简单、实用、结果可靠。
尤其是在筛选MM Ps的抑制剂时,该方法省时,省实验药物。
1 材料与方法1.1 常规仪器和试剂 垂直电泳槽和电泳仪(美国B io-Rad公司),图像分析系统(上海复日科技有限公司),96孔板(瑞典Nunc 公司),培养瓶,CO2培养箱(德国Heraeus公司),超净工作台,震荡器等。
明胶,Triton X-100(购自华美生物技术公司)。
1.2 酶谱电泳专用梳子和边条 自制专用梳子和边条的厚度1.2mm,齿孔宽度为13.3mm,每个梳子有5个孔。
1.3 试剂配制 1%明胶溶液;2×电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖,0.2%溴酚蓝,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8);电泳缓冲液25mmol/L Tris,250mmol/L甘氨酸,pH8.3,0.1%SDS;聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:①30%的丙烯酰胺溶液;②1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8);③1.5mol/L Tris-HCl(p H8.8);④10%SDS;⑤10%过硫酸铵;⑥10%TEM ED;2.5%Triton X-100溶液;明胶酶缓冲液50mmol/L Tris,10mmol/L CaCl2,200mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2 (pH7.5);染色液0.1%考马斯亮蓝R-250;脱色液甲醇∶水∶冰醋酸=45∶45∶10.1.4 样品制备 ①人成纤维细胞(Fb)和人肝癌细胞(HHCC)培养至对数期,用0.25%胰酶消化,以105/孔的密度接种于96孔板中,培养24h;②第二天,弃去培养上清,用PBS洗2次后,加300μl 无血清培养液,培养24h;③收集无血清培养细胞上清,低速离心(200g)去除细胞碎片后,4℃备用。
免疫组化、明胶酶谱、Western
免疫组化、明胶酶谱、W estern实用医院临床杂志2010年9月第7卷第5期免疫组化,明胶酶谱,WesternBlot检测涎腺肿瘤中基质金属蛋白酶MMP一2,MMP.9表达的比较与评价田鲲,彭敏,陈宇2,耿-72(1.四川省医学科学院?四川省人民医院口腔科,四川成都610072;2.四川大学华西口腔医学院病理科,四川成都610041)【摘要】目的评价免疫组化,明胶酶谱,Westernblot检测涎腺良恶性肿瘤中基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-9表达的优点与局限性.方法分别运用免疫组化,明胶酶谱,Westernblot对34例涎腺良恶性肿瘤进行MMP-2,MMP-9定位,半定量,定量检测和活性酶含量的分析,比较各方法检测结果的差异.结果免疫组化方法能定位,半定量检测出基质金属蛋白酶在良恶性肿瘤间的差异;Westernblot能定量说明基质金属蛋白酶在良恶性肿瘤间的差异;明胶酶谱法能检测出MMP一2,MMP-9酶原和活性酶在良恶性肿瘤间的差异.结论免疫组化,Westernblot,明胶酶谱三种方法结合,既发挥免疫组化细胞定位的优势,又克服了免疫组化法非精确定量的弱点,并打破其不能辨别酶原与活性酶的局限性,更加客观准确反映各型肿瘤组织中MMP-2,MMP-9的实际表达.【关键词】免疫组化;明胶酶谱;WesternBlot;涎腺肿瘤;基质金属蛋白酶【中图分类号】R739.87【文献标识码】A【文章编号】1672-6170(2010)05-0017-0517DetectionoftheexpressionofMMPI2andM[MP_9byimmunohistochemistry.gelatinzy- mographyandWesternblotanal ysisinsalivaryglandtumorsTIANKun’,PENGMin,CHENY u, GENGNing2(1.DepartmentofStomatology,SichuanAcademyofMedicalSciencesandSichuanProvi ncialPeople’SHospi-tal,Chengdu610072,China;2.DepartmentsofOralPathology,WestChinaCollegeofStomatology.Sic huanUniversity,Chengdu610041.China)【Abstract】ObjectiveTocomparethemeritsandlimitationsofimmunohistochemistry-GelatinzymographyandWes ternblotanalysisinthedetectionofproteinexpressionofMMP-2andMMP-9insalivaryglandtumors.Meth odsImmunohistochem—istry,GelatinzymographyandWesternblotanalysiswereusedin8malignantand26benignsalivaryandt umorstocarryoutlo—ealization.semi—quantitativedetection,quantitativedetectionandenzymeactivityanalysisforMMP-2andMMP-9.ResultsIm—munohistochemicalmethodcouldlocateandsemi—quantitativedetectthedifferencebetweenmatrixmetalloproteinasesinbenignandmalignanttumors.Westernblotcouldquantitativedescribethedifferencebetweenmatrixmetallopr oteinasesinbenignandmalignanttumors.ZymographycoulddetectdifferencesbetweenzymogenandactiveenzymeofMMP-2andMMP-9inbenignandmalignanttumors.ConclusionThecombinationofimmunohistochemistry,GelatinzymographyandW esternblotanalysiscannot onlyplaytheadvantageofcellularlocalizationbyimmunohistochemistryalone-butalsoovercomethew eaknessesofinexactquan—titativebyimmunohistochemistryandthelimitationsofnondiscernmentofproenzymeandactiveenzy me,SOastoreflecttheactualexpressionofMMP-2andMMP-9invarioustypesoftumortissuemoreobjectivelyandaccurately.【Keywords】Immunohistochemistry;Gelatinzymography;Westernblot;Salivaryglandtumor;Matrixmetalloprotei nase基质金属蛋白酶一MMP’2,MMP-9是主要降解基底膜上IV型胶原的基质金属蛋白酶类,与恶性肿瘤浸润转移的关系尤为密切….近年来,对MMP一2,MMP-9的研究较为深入和广泛,研究方法也分门别类.就蛋白水平而言,主要实验手段有免疫组织化学,免疫荧光,酶联免疫吸收检测,胶原底物降解检测,Westernblot印迹,Southwestern印迹,明胶酶谱法等等¨J.各种方法侧重点不尽相同,其中免疫组织化学和免疫荧光重点在蛋白的组织定位和半定量,酶联免疫吸收检测,胶原底物降解检测,Westernblot印迹,Southwestern印迹几种方法在严格控制实验条件的前提下可以做到蛋白定量检测,而明胶酶谱则能够区分酶原和活化酶.若综合考虑实验设备,技术手段,经费预算等多方面因素,最常用的还是免疫组化,免疫荧光,胶原底物降解,明胶酶谱几种方法.本研究分别采用免疫组化,明胶酶谱,Westernblot三种方法检测MMP一2,MMP-9的活性,评价三种方法检测MMP-2,MMP-9表达的优点与局限性,为更加客观准确的反映各型肿瘤组织中MMP-2,MMP-9的实际表达,探讨出一种经济,快速,准确的检测手段.1材料与方法1.1材料选择四川省医学科学院?四川省人民医院口腔颌面外科及四川大学华西口腔医学院颌面外科涎腺肿瘤患者手术切除新鲜组织,其中良性肿瘤26例(基底细胞腺瘤3例,肌上皮瘤3例,多形性腺瘤20l8例),恶性8例(黏液表皮样癌,腺样囊性癌各2例,腺泡细胞癌,恶性肌上皮瘤各1例,低分化腺癌2例).排除复发涎腺肿瘤和术前曾接受抗肿瘤治疗的患者.1.2方法1.2.1免疫组化sP法单克隆抗体MMP一2,MMP-9,sP试剂盒购自ZYMED公司(1:100).3%H0:封闭内源性过氧化物酶,微波加热抗原修复,10%正常羊血清孵育,滴加一抗,4℃冰箱中过夜,PBS缓冲液(Na2HPO48.1mmol/L,KH2PO41.5mmol/L,NaC1137 mmo]/L,2.7mmol/LpH7.4)振荡清洗后分别滴加二,三抗,DAB显色,苏木素复染,常规封片.1.2.2明胶酶谱法标本离体后一70℃冰箱内保存.常规匀浆,离心制备组织蛋白抽提液,提取上样于含0.1%明胶的7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS.PACE电泳,分子量Marker采用低分子量蛋白标准品.电泳结束后将胶体置于洗脱液(2.5%TritonX.100)中震荡洗涤;明胶缓冲液(50mM/LTris,100mM/LCaCI2,200mM/LNaC1,1txM/LZnC1)37℃孵育l8小时,此步骤为证实反应产物确为MMP一2,MMP-9,可分别在明胶缓冲液中加入其非特异性抑制剂EDTA20mmo]/L,特异性抑制剂苯甲基磺酰胺20mmol/L,以明确所得条带的性质,同法孵育.孵育结束后考马斯亮蓝溶液染色1小时,脱色约30～40分钟,得到蓝色背景上的透亮带.1.2.3Westernblot同明胶酶谱法制备组织蛋白抽提液,提取上样于8%聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS- PAGE电泳,半干式转膜(PVDF膜),50mA恒流3小时.封闭液(0.O1%正丁醇,0.02%Tween,5%脱脂奶粉,0.02%叠氮钠w/v)封闭PVDF膜过夜,PBS.T缓冲液(Na2HPO4’12H200.725%,NaH2P04?2H20Q074%,实用医院临床杂志2010年9月第7卷第5期NaC10.87%,Tween-200.001%w/v)中充分振荡清洗,分别滴加一,二,三抗(抗体来源同免疫组化法),一抗终浓度为1g/ml,二,三抗稀释比例为1:6000,DAB显色.1.3结果判断1.3.1免疫组化参考Nagell5J的方法并加以改良进行计分,无阳性细胞为阴性,记为0;染色阳性细胞数< 10%记为1分;10%～50%记为2分;>50%记为3分. 1.3.2明胶酶谱,Westernblot4500000像素数码照相机拍照,imageproplus4.10版本的专业图像分析软件进行图像分析,记录积分光密度IOD.1.4统计学方法以SPSS10.0统计学软件处理数据,采用Mann—Whitney检验和Logistie回归分析.i?2结果2.1免疫组化阳性信号呈棕色细颗粒状,定位舯瘤细胞胞浆内,镜下积分结果见表1.MMP一2在全部34例肿瘤中有不同程度表达(34/34),良性肿瘤中MMP-9呈阴性(肌上皮瘤1/3,基底细胞腺瘤2/3).按前述标准计分后进行统计学分析,发现涎腺恶性肿瘤MMP-2的表达强于良性肿瘤(U=3.000,P=0.018);MMP-9在恶性肿瘤中的表达(均值1.556)也高于良性肿瘤(均值0.667),但二者间差异无统计学意义(U=23.000,P=0.069)见图1.黏液表皮样癌中MMPs因肿瘤细胞种类不同而表达不同:表皮样细胞和中间细胞表达较高(均值2),黏液细胞表达很少(均值1);腺样囊性癌中MMPs在不同的组织结构区域其表达也不相同:条索实性区域上皮细胞(均值2)表达强于腺管-筛孔样区域(均值1.5).表1各型肿瘤免疫组化染色计分结果(分)2.2明胶酶谱从上到下观察得到的蓝色背景凝胶块,可以看到五条带:分子量92KDa的MMP-9酶原;分子量83KDa的活性MMP-9;72KDa的MMP一2酶原;64KDa的中间型MMP一2,是去除了8KDa的肽段,但未完全激活,只有低分化腺癌(IOD值42570.91),黏液表皮样癌(IOD值32127.23)和腺样囊性癌(IOD值41998.5O)有所表达;62KDa的活性MMP一2条带(见图2).MMP一2酶原在全部样本中都有较强表达(表2),良性,恶性肿瘤间差异不明显(U=22.500,P=0.52).活性MMP.2在所有样本都有一定表达,恶性肿瘤的表达水平高于良性肿瘤(U=9.500,P=0.011).MMP-9酶原,活性MMP.9在大部分良性肿瘤中表达很低或缺失,在恶性肿瘤中均有明确表达(U=0.000,U=2.500,P=0.031,P=0.022).部分低分化腺癌和腺样囊性癌中,在MMP一2酶原和活性MMP一2带问可见一条微弱的64KDa透明条带,颜色较浅,即为中间型MMP-2.实用医院临床杂志2010年9月第7卷第5期,奄iit聋图1MMP-2,MMP-9免疫组化结果a:基底细胞腺瘤MMP一2(10~40),部分肿瘤细胞胞浆着色.b:基底细胞腺瘤MMP一9(10x40),个别肿瘤细胞胞浆着色;c:多形性腺瘤MMP-2(10x40),部分肿瘤细胞着色;d:多形性腺瘤MMP-9(10x40),肿瘤细胞几乎不着色;e:低分化腺癌MMP一2(10x40),绝大部分肿瘤细胞着色,信号较强;f:低分化腺癌MMP一9(10x40),大部分肿瘤细胞着色表2各型肿瘤中MMP酶原与活性MMP的IOD平均计分值(分)MMP一9酶原一活性MMP一9一MMP一2酶原一活性MMP一2一多形性腺瘤基底细胞腺瘤肌上皮瘤腺泡细胞癌腺样囊性癌多形性腺瘤图2涎腺肿瘤的明胶酶谱结果腺样囊性癌黏液表皮样癌2.3Westernblot受所购抗体适用范围的限制,本实验只对34例涎腺肿瘤进行MMP-2的Westernblot检测.得到的PVDF膜在相应分子量区域(72KDa)见一条长方形棕黄色抗原条带,即为所检测的MMP-2组织蛋白条带(图3).由于转移过程中蛋白浓度减少,故膜上的显色条带较浅,肌上皮瘤,基底细胞腺瘤的有些条带肉眼几乎不能辨认,通过计算机成像分析才能检测到.良恶性肿瘤间MMP一2的表达存在差异(P=0.029).MMP一2—一多形性腺瘤基底细胞腺瘤黏液表皮样癌腺泡细胞癌腺样囊性癌多形性腺瘤腺样囊性癌图3涎腺肿瘤的WesternBlot结果基底细胞腺瘤～72KDa2.4三种方法的结果比较将免疫组化所测的MMP一2计分值与Westernblot法测得的IOD值标准化后进行比较,得到图4的分布趋势,Westernblot与免疫组化检测的MMP一2表达强度一致.Westernblot是定量检测,免疫组化是半定量检测,二者趋势一致说明免疫组化实誊镡罐t20验所得数据是真实可信的.免疫组化实验不能检测出涎腺良恶性肿瘤问MMP一9的表达差异,明胶酶谱法不但能检出总MMP一9的差异,还能检出MMP一9酶原,活性MMP一9的差异.从图5_口f以看,MMP一2,MMP一9在涎腺良恶性肿瘤中表达不同主要是由于活性MMP一2, MMP一9表达不同所造成.嘎魍馥厂_1411-WesternBlot~肿瘤类型图4免疫组化与WesternBlot所测MMP一2在各型肿瘤间趋势一致良性恶性良性恶性图5涎腺良,恶性肿瘤中MMP活性酶与酶原的构成比3讨论迄今为止,免疫组化方法仍是原位检测组织蛋白最直观,应用最广的方法,在检测基质金属蛋白酶蛋白的实验中,它不仅提供了各型肿瘤问,各种因子间半定量的比较数据,更重要的是做到了组织定位,从形态学上反映了MMPs的表达规律.如黏液表皮样癌中MMPs主要表达在表皮样细胞和中间细胞,黏液细胞着色少;腺样囊性癌中,条索状实性区域上皮细胞表达强于腺管一筛孑L样区域.根据组织学分级,黏液细胞分化相对成熟,而表皮样细胞和中间细胞分化较低,显示了较强的生长活性.该结果支持Ross的结论:中间细胞是黏液表皮样癌中最具侵袭性的细胞.多数学者认为’腺样囊性癌中实性条索样区域较腺管和筛孑L样区域浸润性更强,本研究中也显示MMPs在这些区域中的表达更强.这些细胞定位特征提示了MMPs在涎腺恶性肿瘤浸润,侵袭过程中的重要作用.但由于实验中主观因素干扰较多,如阳性信号的强弱受室温,空气湿度,溶液离子浓度等非控制因素的影响,各批次着色程度差异较大,另外阳性判断也因主观认实用医院临J末杂志2010年9月第7卷第5期识不一而有所差异,故免疫组织化学只能对所检测蛋白的表达强弱进行半定量比较.本实验辅以Westernblot定量方法进行补充,使设计更加严谨,结果更加可信.明胶酶谱法是一种分酶原和活性酶的特异性方法.MMP一2,MMP一9都是以酶原形式分泌,在细胞外环境中其N末端一肽段被切下来后即转变为活性形式.实验中运用非还原SDS—PAGE电泳,利用MMPs与阴离子去垢剂SDS结合,形成蛋白质一SDS复合物,使待测蛋白质带上相同的负电荷,其量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质问原有的电荷差别,此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量.SDS—PAGE电泳后,将分子量不同的MMPs及与MMPs结合的组织抑制剂同时分离,再用阳离子去垢剂(Trtion—X100)除去SDS,这一过程中引发了MMPs酶原蛋白体外活化机制,酶原在凝胶内除掉一个约l0×10KDa的小肽,转变为有活性的酶,降解凝胶中相应部位的明胶.体内已被纤溶酶等物质激活的活性MMPs,在除掉SDS后也可以恢复酶活性,在酶谱上称之为活性型MMPs,可在比酶原分子量小10X10KDa处留下白色透明条带,从而与酶原相区别.活性酶在体内才具有水解胶原等基质的作用,冈而在功能上的意义要大于相应的酶原.本研究免疫组化结果显示恶性涎腺肿瘤中MMP一2的表达强于良性肿瘤,明胶酶谱实验则进一步证实是活性MMP一2表达不同导致这一差异,MMP一2酶原的分泌量在二者问差异是不明显的,这也更加清晰的显示在恶性肿瘤中MMP一2通过增加激活量促进了肿瘤细胞的侵袭,转移.MMP一9在恶性涎腺肿瘤中的表达强于良性肿瘤,但免疫组化实验不能发现统计学上的差异.明胶酶谱法显示:不仅活性MMP-9而且MMP一9酶原的分泌在二者也有重要差异,证实MMP一9同样参与了肿瘤组织降解细胞外基质,开辟浸润,转移通道的过程.此外,酶谱实验还显示了部分恶性涎腺肿瘤中中间型MMP一2的表达,在MMP一2酶原的激活过程中,中间型MMP一2相当于一个储备库,维持活性型MMP一2的高浓度,不因MMP一2酶原的量暂时变化而影响最终活性酶的浓度,维持了细胞外基质的降解速率”.本实验在涎腺良性肿瘤中未发现中间型MMP-2表达,而一些恶性肿瘤中能检测到其存在,说明随着涎腺恶性肿瘤持续生长,作为活性酶的储备库中问型MMP一2将不断转化为活性MMP一2,使活性酶持续增高或维持在一个相对较高的水平,令细胞外基质持续降解.综上所述,免疫组化,Westernblot,明胶酶谱三种方法结合既发挥了免疫组化细胞定位的优势,打破其不能辨别酶原与活性酶的局限性,又克服了免疫组化法半定量的局限性,能更加客观准确反映各型肿瘤组织中MMP一2,娜∞∞加0实用医院临床杂志2010年9月第7卷第5期基质金属蛋白酶I2和层粘连蛋白受体表达与胃癌生物学行为的关系王克兵,徐(1.贵州省遵义县人民医院病理稃,贵州遵义563100;2.澍2贵阳医学院附属医院病理科,贵J’i1贵阳550004)21【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶一2(MMP一2)和层粘连蛋白受体(1amininreceptor,laminin.R)在胃癌中的表达与胃癌生物学行为的关系.方法采用免疫组化EnvisionTM法检测82例胃腺癌组织中MMP.2和laminin.R的表达情况,分析其与胃癌生物学行为的关系.结果MMP-2和laminin—R在胃癌中的阳性表达率分别为62.2%和52.44%;MMP.2和laminin—R与患者年龄,性别,肿瘤发病部位,肿瘤大小和分级均不相关(P>0.05);MMP-2蛋白表达与浸润深度,TNM分期相关(P<0.01,P<0.01);laminin—R表达与胃癌浸润深度,淋巴结转移,TNM分期相关(P<0.01,P<0.05,P<0.01);MMP一2和laminin—R在胃癌中表达呈正相关关系(r:0.72).结论胃癌组织中MMP一2与laminin—R表达参与胃癌的侵袭和淋巴结转移.【关键词】胃癌;基质金属蛋白酶-2;层粘连蛋白受体;生物学行为【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1672-6170(2010)05-0021-03 Matrixmetalloproteinase-2andlamininreceptorinassociationwithbiologicalbehaviorof gastriccarcinomaW ANGKe—bing,XUShu(1.DepartmentofPathology,ZunyiPeople’sHospital,Zu nyi563100,China;2.DepartmentofPathology,TheAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege.Guiyang5500 04,China)【Abstract】mininreceptorandthebiolo gi—calbehaviorofgastriccarcinoma.MethodsTheexpressionsofMMP-2andlamininreceptorin82oasesofgastriccancerweredetectedbyEnvisionTMmethod.ResultsThepositiveratesofMMP一2andlamininreceptoringastriccancerwas62.2%and52.44%respectively.Patients’age,gender,tumorlocation-sizeandgradewerenotrelatedtotheexpressi onofMMP一2andlami—ninreceptor(P>0.05).TheexpressionofMMP-2wassignificantlyrelatedtodepthofinvasion(P<0.01)andTNMstaging(P<0.O1).Theexpressionoflamininreceptorwassignificantlyrelatedtodepthofinvasion(P<0.0 1),lymphnodemetas—tasis(P<0.05)andTNMstaging(P<0.01).TheexpressionofMMP一2andlamininreceptoringastriccancerwaspositivecorrelated(r=0.72).ConclusionTheexpressionofMMP-2andlamininreceptoringastrictissuesisinvol vedintheinva—sionandlymphnodemetastasisofgastriccancer.【Keywords】Carcinomaofstomach;Matrixmetalloproteinase?2;Lamininreceptor;Biologicalbehavior基质金属蛋白酶.2(MMP一2)的主要功能是参与细【基金项目】贵州省科学技术基金资助项目[黔科合J字(2008)2278]9的实际表达,是一种可行的三联检测手段.【参考文献】『11RobeaVisse.HideakiNagase.Matrixmetaloproteinasesandtissueinhibi. toysofmetaloproteinases:structurefunction,andbiochemistry[J].Circu—lationResearch,2003,92(5):827.839.[2]Le6niewskaM,MihykW,SwiateckaJ,eta1.Estrogenreceptorbetapar—ticipateintheregulationofmetabolizmofextracellularmatrixinestrogen alphanegativebreastcancer[J].FoliaHistochemCytobiol,2009,47(5):S107—112.『3]KatayamaA,BandohN,KishibeK,eta1.Expressionsofmatrixmetallo.proteinasesinearly-?stageoralsquamouscellcarcinomaaspredictiveindi-? catorsfortumormetastasesandprognosis[J].ClinCancerRes,2004,10(2):634-640.[4]刘煜,张嘉宁,朱正美.基质金属蛋白酶酶谱分析法[J].生殖医学杂志,1998(7):111—113.[5]NagelH,LaskawiR,WahlersA,eta1.Expressionofmatrixmetalloprotei-胞外基质(ECM)降解,有研究报道其在胃癌中表达与胃癌的局部浸润和远处转移发生密切相关….层粘连蛋白受体(Lamininreceptor,laminin—R)作为一种细胞粘附分子,参与基底膜成分一层粘连蛋白结合.已有研究nasesMMP-2,MMP-9andtheirtissueinhibitorsTIMP一1,-2,and-3in benignandmalignanttumoursofthesalivarygland[J].Histopathology,2Oo4,44(3):222-231{6]ROSSB.Astudyoftheteterogeneityofthemueoepidermoidtumorandthe implicationforfutureetherapyes,ArchOtolaryngol[J].HeadNeckSurg,1992,118:l172-1178.『7]Raitz.Martins,Araujo.Astudyoftlleextraeellularmatrixinsalivary glandtumors[J].JOralPatholMed,2003,32(5):290-296.[8]谢刚,杨永红,王安群,等.气管腺样囊性癌临床病理分析[J].实用医院临床杂志,2008,5(3):66-68.[9]LaemnliUK.Cleavageofstmcturalproteinsduringtheassemblyofthe headofbacteriophageT4[J].Nature,1970,227:680.『1O1PeiD.Leukolysin/MMP25/MT6.MMP:anovelmatrixmetalloproteinase specificallyexpressedintheleukocytelineage[J].CellRes,1999,9:291.303.f11]HomebeckW,EmonardH,MonboisseJC,eta1.Matrix.directedregula- tionofperieellularproteolysisandtumorprogressionlJ1.SeminCancerBiol,2002,12(3):231-241.(收稿日期:2010-06-03;修回日期:2010-07-20)。
酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2010(031)007【总页数】2页(P513-514)【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016【正文语种】中文【中图分类】R282.71肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。
近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。
为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。
1 材料与方法1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。
明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。
明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。
通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。
这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。
这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。