明胶酶谱分析法
蛋白酶活性电泳实验
蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。
通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。
通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。
二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。
水为去离子水或超纯水。
主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。
使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
明胶酶谱法 -回复
明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。
明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。
这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。
明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。
在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。
明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。
这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。
明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。
这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。
明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。
在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。
明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。
明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。
明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。
在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。
明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。
明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。
这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。
明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。
该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。
明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。
明胶酶谱法
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
改良明胶酶谱测定明胶酶活性
·简 报·改良明胶酶谱测定明胶酶活性①710032 西安 第四军医大学细胞工程研究中心 骞爱荣 商 澎 陈志南②关键词 明胶酶谱;基质金属蛋白酶;电泳;聚丙烯酰胺凝胶中图分类号 R965.2 基质金属蛋白酶(M MPs)是能降解细胞外基质和基底膜成分的酶家族成员之一。
这个蛋白家族包括胶原酶、明胶酶、基质素和膜型基质金属蛋白酶(M T-M MP)等5大类。
MMPs家族成员目前已鉴定出28种[1]。
M MP的基因表达水平和酶活性的高低与许多生理或病理过程及其恶性程度相关,如肿瘤转移、血管浸润、骨质疏松、组织纤维化等,尤其是明胶酶A和B(MMP-2,9)在肿瘤的转移和血管生成方面起重要的作用[2]。
目前,测定明胶酶活性的方法多用明胶酶谱法(gelatin zymog-raphy),即收集待测样本,处理后在含有明胶-聚丙烯凝胶中进行SDS-PAGE。
但是,传统的方法样品处理费时、费事。
因此,从方法学的角度,寻找简便实用的检测MM Ps活性的方法有重要的意义。
本文介绍一种改良的明胶酶谱方法,较好地解决了实验中遇到的一些难题,且简单、实用、结果可靠。
尤其是在筛选MM Ps的抑制剂时,该方法省时,省实验药物。
1 材料与方法1.1 常规仪器和试剂 垂直电泳槽和电泳仪(美国B io-Rad公司),图像分析系统(上海复日科技有限公司),96孔板(瑞典Nunc 公司),培养瓶,CO2培养箱(德国Heraeus公司),超净工作台,震荡器等。
明胶,Triton X-100(购自华美生物技术公司)。
1.2 酶谱电泳专用梳子和边条 自制专用梳子和边条的厚度1.2mm,齿孔宽度为13.3mm,每个梳子有5个孔。
1.3 试剂配制 1%明胶溶液;2×电泳载样缓冲液(5%SDS,2%蔗糖,0.2%溴酚蓝,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8);电泳缓冲液25mmol/L Tris,250mmol/L甘氨酸,pH8.3,0.1%SDS;聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液:①30%的丙烯酰胺溶液;②1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8);③1.5mol/L Tris-HCl(p H8.8);④10%SDS;⑤10%过硫酸铵;⑥10%TEM ED;2.5%Triton X-100溶液;明胶酶缓冲液50mmol/L Tris,10mmol/L CaCl2,200mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2 (pH7.5);染色液0.1%考马斯亮蓝R-250;脱色液甲醇∶水∶冰醋酸=45∶45∶10.1.4 样品制备 ①人成纤维细胞(Fb)和人肝癌细胞(HHCC)培养至对数期,用0.25%胰酶消化,以105/孔的密度接种于96孔板中,培养24h;②第二天,弃去培养上清,用PBS洗2次后,加300μl 无血清培养液,培养24h;③收集无血清培养细胞上清,低速离心(200g)去除细胞碎片后,4℃备用。
酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2010(031)007【总页数】2页(P513-514)【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016【正文语种】中文【中图分类】R282.71肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。
近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。
为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。
1 材料与方法1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验方法明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
明胶酶谱法
明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。
明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。
明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。
通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。
这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。
这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。
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明胶酶谱分析法
一。
用品
1.细胞培养或者提取组织
2.试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml（包括）
ddH2o 1.5ml 15ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）1.65ml 4.95ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）1.25ml 3.75ml
10% SDS 50ul 150 ul
10%过硫酸铵50ul 150 ul TEMED 4ul 12 ul
1%明胶0.5ml 1.5 ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶3ml
ddH2o 2.1ml 6.3ml
30%储备胶0.5ml 1.5ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 1.14ml
10% SDS 30ul 90 ul
10%过硫酸铵30ul 90 ul
TEMED 3ul 9 ul
（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2）8ml
16%甘油3.2 ml
溴酚蓝0.024g
ddH2o 2.4ml
(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6
漂洗液；50mmol/L Tris -HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 （7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸
（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%
二：步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。
4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样（根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次45分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育18h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项：
1．制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
2．明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。