Gel Zymography 明胶酶谱法
明胶酶谱法检测步骤
明胶酶谱法检测步骤1、明胶酶谱溶液配制1.1.1洗脱液（1×）：1.1.2Triton X-100，2.5%（v/v）in water配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。
1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。
配法：1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g；2)加水至800ml；3)用浓HCl调pH至7.6；4)定容至1000ml。
1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml10%（w/v）SDS 4.0ml0.1%溴酚蓝0.5mldH2O1mlTotal10ml1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）配法：1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5mlb)SDS1gc)溴酚蓝0.05gd)甘油5ml2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀；3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。
1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml配法：1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中；2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀；4)加入260ml去离子水，搅拌溶解；5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。
1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml）配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。
1.1.7明胶储液（10mg/ml in water）配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。
配好后储存于4℃。
明胶酶检测方法研究进展_陈秋凤
明胶酶检测方法研究进展陈秋凤1，周防震21．湖北民族学院附属医院（湖北恩施445000）2．湖北民族学院生物科学与技术学院（湖北恩施445000）【关键词】明胶酶；检测方法；进展【中图分类号】R739．87【文献标识码】A【文章编号】1008－8164（2012）01－0070－02明胶酶，亦称Ⅳ型胶原酶［1］、基底膜性胶原酶［2］等，属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloprotein-ases，MMPs）范畴，包括明胶酶A（MMP－2或称72kDaⅣ型胶原酶）和明胶酶B（MMP－9或称92kDa Ⅳ型胶原酶），可降解Ⅳ型胶原、明胶和V型胶原等基底膜成分，在组织炎症［3］、纤维化［4，5］、免疫［6］与肿瘤转移［7 9］等诸多过程中发挥重要作用。
明胶酶检测方法从最初的明胶酶谱法到现在采用的ELISA 法，从粗略定性到逐渐发展为准确定量，方法稳定性、可靠性逐渐完善，操作也变得更为简单。
本文就明胶酶测定方法的研究进展进行综述。
1基于明胶酶催化活性的检测方法利用明胶酶能催化降解明胶的特点发展建立起来的检测方法主要有明胶酶谱法（Zymography）、荧光明胶酶法和DQ明胶（Dye－quenched－gelatin）原位酶谱法。
1．1明胶酶谱法Kleiner等［10］于1994建立此方法，是一种基于非还原SDS－PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法。
主要原理是：1）含明胶酶的样本首先上样进行非还原SDS－PAGE电泳，利用明胶酶与阴离子去垢剂SDS结合，形成蛋白质－SDS 复合物，使待测蛋白质带上相同的负电荷，其量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，此时蛋白质分子在凝胶中的迁移率取决于其分子质量大小；2）SDS－PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂（Triton－x100）的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10kDa的小肽，转变为有活性的酶［11］，降解凝胶中相应部位的明胶。
明胶酶谱法 -回复
明胶酶谱法 -回复明胶酶谱法是一种用于测定明胶酶活性的分析方法。
明胶酶谱法基于明胶酶对明胶的降解作用，通过测定明胶的降解程度来反映明胶酶活性。
这种方法可以在实验室中进行，通常需要一些特定的试剂和设备。
明胶酶谱法的原理是利用明胶对明胶酶的敏感性，通过观察明胶降解的速度来确定酶的活性。
在明胶酶谱法中，一般会选择特定浓度和分子量的明胶，以确保最佳的测定结果。
明胶酶谱法可以用来研究明胶酶对明胶的降解过程，了解酶的活性和特性。
这个方法可以应用于食品工业、制药工业等领域，用于检测明胶酶的活性和质量。
明胶酶谱法在实验室中的操作比较简单，但需要一定的实验操作技巧和对仪器的熟悉。
这种方法对明胶酶活性和测定结果的准确性有着重要影响，所以需要严格按照操作流程进行实验。
明胶酶谱法的操作流程包括样品制备、反应过程、数据记录等环节，需要仔细阅读方法说明书并进行实践。
在明胶酶谱法中，常用的数据处理方法有绘制酶活性曲线、计算酶活性单位等。
明胶酶谱法需要注意的问题包括试剂的质量、设备的准确性和对废液的处理等。
明胶酶谱法的优点是操作简便、结果准确可靠，可以在较短时间内完成分析。
明胶酶谱法的局限性在于它只是测定明胶酶活性的一种方法，不能全面了解酶的特性。
在明胶酶谱法中，一些因素如温度、pH值等会对酶的活性产生影响，需要进行恰当的控制。
明胶酶谱法的操作需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
明胶酶谱法是一种常用的分析方法，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
该方法在明胶酶的研究和应用中具有重要意义，可以帮助科学家们更好地了解酶的特性和机制。
明胶酶谱法的结果可以用于酶活性检测、比较不同酶样品的活性等。
这种方法还可以用于评估明胶酶的纯度和稳定性，指导生产过程中的酶的应用。
明胶酶谱法可以与其他分析方法结合使用，提高酶活性测定的准确度和可靠性。
该方法还可以用于研究明胶酶的底物特异性、抑制剂的效果等。
明胶酶谱法的发展使得对明胶酶的研究更加深入和全面。
明胶酶谱法
明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
Mmp-2 72kd mmp-9 92kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶活性
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大旳酶。
➢ NGAL能与MMP-9以二硫键旳方式结合，能起到保护和调整MMP-9功能旳作用，所以NGAL 与肿瘤旳侵袭移动有亲密旳联络。
➢ 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教讲课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体旳SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测成果表白，转染有pcDNA-NGAL (-) 旳SHEEC 细胞 分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显降低；而与此同步，转染有pcDNA-NGAL (＋) 旳 SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显升高。表白经过有义、反义技术使NGAL 基因体现发生变化能够对SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2 旳活性产生明显影响。
➢ 胶原是ECM旳主要成份，目前已发觉，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中旳主要成份。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞旳侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动旳有关基因及其体现调控模式旳变化 和增进细胞移动旳外界原因两者旳共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭旳分子机制还不是十分清楚，但已发觉许多调控细胞侵袭转移旳关 键分子及其信号通路。
脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中断脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到合适大小后，用凝胶图象处理系统分析成果，以白色条 带旳净光密度值相对定量样品中酶活性。
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验方法明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
基础学习实验4-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性
NGAL的三级结构
由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这
八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。
此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端 310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基， 形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。
实验设计
1. 查阅相关资料，讨论MMP-2与MMP-9在食管癌各发展阶段的活性检 测能否作为监控癌症发展的一个指标，应该注意什么问题，其临床意 义如何？ 2. 若发现MMP-2与MMP-9在癌症病人中出现异常，谈谈你可能采取的
含有2个锌离子和5个钙离子
右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合
NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL
与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 细胞 分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL (＋) 的 SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性产生明显影响。
（2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、
Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是
明胶酶谱法
明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。
明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。
明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。
通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。
这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。
这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。
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明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺
（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2（基质金属蛋白酶-2）和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs 恢复了活性。
试剂的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）
2.5ml
10% SDS100ul
10%过硫酸铵（APS）100ul
TEMED8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8)0.76ml
10% SDS60ul
10%过硫酸铵60ul
TEMED6ul
(2)5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
(3)4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2）8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝0.024g
ddH2O 2.4ml
(4)洗脱液：
2.5% Triton X-100
50mmol/L Tris-HCl（6.057g/L）
5mmol/L CaCl2（0.5549g/L）
pH7.6
40分钟两次，中间换液
(5)漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
(6)孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
(7)染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）
(8)脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%,20%,10%,乙酸浓度分别为10%,10%,5%（分别30min,1h,2h脱色）
实验步骤
(1)取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
(2)次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
(3)根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
(4)配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
(5)电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
(6)孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10% ,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项：
(1)制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
(2)明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
(3)用大梳子
(4)孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
(5)孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
(6)明胶要4度保存，配好后1周内使用
凝胶制备：
(1)玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
(2)配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。
若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
(3)配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
(4)将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
(5)拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。
【PS 某种酶蛋白活性分析】
（1）用于测定蛋白酶活性。
（2）三个主要内容：生物轭合物；试剂盒；分析方法。
（3）生物轭合物包含：连接物；荧光剂；猝灭剂。
（4）连接物包含能识别所检测的酶并且与之相互作用的部分；荧光剂包含多种荧光物质，并与所述连接物的第一位置轭合；猝灭剂与所述连接物的第二位置轭合。
连接物上能识别蛋白酶并与之相互作用的部分位于第一和第二位置之间。
多种荧光物质相互结合，使得猝灭剂能放大荧光剂的超猝灭。