第六章、基于全基因组序列的高通量基因克隆

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分子生物学研究法-基因功能研究技术

分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。

但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。

如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。

转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。

用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。

酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。

随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。

本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。

6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。

基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。

通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。

高通量的基因克隆

系的顺利实施。另外，在很多情况下，如在启动子和外显子的研究、白质的表达中要求在克隆时不能蛋
其引物的一端是与线性载体的末端同源的序列，将目的片段与线性载体转入酵母细胞，用酵母体内利的重组系统便可使其在体内进行同源重组。
型的应用。高通量克隆法目前主要有重组法克隆与不需要连接的克隆（ｉａｉｎｉｄｐｎｅｔｃｏｉｇ，１ｔｎｅｅｄｎｌｎｎｇｏ
１１１酵母同源重组克隆利用酵母具有的双链．．
损伤修复机制使体内的线性双链分子发生同源重
组］。利用特异的引物对目的基因片段进行扩增，
且，存在于基因内部的酶切位点将阻碍这种克隆体
隆方法原理和特性进行了介绍。关键词：通量克隆；因克隆；组克隆；需要连接的克隆高基重不
中图分类号：８Ｑ７文献标识码：Ｂ文章编号：０７５３（０８０ — １００１０ — ０８２０）１００ — ４
随着大规模基因组测序技术的进步，个物种各的基因测序也相继完成［］对基因及其产物的功能１，研究和阐明也开始成为当今生物医学和制药领域研究的热点，因的大规模克隆和表达给后基因组学基

人教版高中生物必修二第六章第2节《基因工程及其应用》设计

6-2 基因工程及其应用教学设计教材分析1. 教学内容分析高中生物必修2遗传与进化模块第6章从杂交育种到基因工程是整本书的一个重点内容。

而该章的第2节基因工程及其应用中，基因工程的原理及基本操作程序又是该章节的重中之重，在本章中起到承上启下的作用，上承DNA重组技术的基本工具，下接基因工程的应用，难点多，内容杂，较抽象，学生不易理解，学好这部分内容对学生从遗传与变异角度理解生命活动至关重要。

2. 课程标准要求搜集生物变异在育种上应用的事例。

关注转基因生物和转基因食品的安全性。

教学目标（三维教学目标）【知识目标】1、简述基因工程的基本原理。

2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。

3、关注转基因生物和转基因食品的安全性。

【能力目标】进行转基因生物和转基因食品安全性的资料搜集和分析。

【情感目标】1、关注转基因生物和转基因食品的安全性。

2、讨论从杂交育种到基因工程这一科技发展历程中，科学、技术和社会的相互作用。

教学重点：1、基因工程的基本原理2、基因工程的操作过程教学难点：1、基因工程的基本原理2、基因工程的操作过程教学策略或方法：从对杂交育种及诱变育种的特点总结入手，结合“问题探讨”，引入基因工程的概念，将重点放在引导学生了解基因工程的基本原理和大致过程上。

在教学过程中，结合学生熟悉的具体事例来讲述，并安排学生制作模型来模拟基因工程的操作过程，使学生切身体会基因工程“剪、拼、接、转”的主要过程。

本节课的侧重点是基因工程的原理，因此在教学深度上定位于学生了解基因工程的过程和方法，不必引入过多的专业术语和详细的操作技术。

通过本节课的学习，学生应了解基因工程所用到的“工具”和基因工程的大致过程。

教学方法为讲述法、讨论法教学用具：黑板、粉笔、多媒体课件教学板书：基因工程一、概念：二、步骤：1、提取目的基因；2、目的基因与运载体的结合；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测和表达。

三、工具：基因剪刀——限制性内切酶基因针线——DNA连接酶基因的运载体——质粒、噬菌体、动植物病毒等。

基因操作原理名词解释

第一章1. Gene manipulation基因操作。

将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。

2. Interrupted genes间断基因。

序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。

我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。

3 .Promotor启动子。

DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。

4. Subcloning亚克隆。

当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。

第二章1.Restriction and modification限制和修饰。

宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。

外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。

2. Matched ends匹配末端。

识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。

3. Blunt ends平末端。

在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。

4. Isoschizomer ：同裂酶。

识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

5. Isocaudiners ：同尾酶。

来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。

6.Site preferences ：位点偏爱。

某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。

7.Star activity 星星活性。

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

8. Nicking enzyme 切口酶。

基于全基因组测序的逐步克隆法的重要步骤

基于全基因组测序的逐步克隆法的重要步骤全基因组测序是一种非常重要的分子生物学技术，在生物学研究以及医学诊断和治疗中有着广泛应用。

而基于全基因组测序的逐步克隆法则是一种常用的策略，用于获取特定基因或片段的完整序列。

下面将详细介绍基于全基因组测序的逐步克隆法的重要步骤。

第一步：建立文库基于全基因组测序的逐步克隆法的第一步是建立基因组文库。

该文库由目标生物的DNA组成，其中包含了整个基因组的所有序列。

为了建立文库，首先需要提取目标生物的基因组DNA。

然后，将DNA片段进行随机酶切或机械切割，生成一系列不同长度的DNA片段。

接下来，将这些DNA片段连接到适当的载体上，并将其插入能够容纳大片段DNA的宿主细胞中。

第二步：测序文库建立完基因组文库后，接下来需要对文库进行测序。

目前，测序方法主要有两种：Sanger测序和高通量测序。

Sanger测序是一种传统的测序方法，通过测定DNA链延伸过程中释放的荧光信号来确定碱基顺序。

高通量测序则是一种快速且高效的测序技术，通过将DNA分成数以百万计的小片段，同时进行测序，并通过计算机软件将这些小片段的顺序重新组合成完整的序列。

第三步：选择目标基因或片段测序完基因组文库后，接下来需要选择目标基因或片段。

根据研究目的和克隆策略，可以选择特定基因、序列长度或其他目标。

基于全基因组测序的逐步克隆法的一大优势就是可以同时获取整个基因组的信息，因此可以根据需要选择感兴趣的基因或片段进行进一步研究。

第四步：设计引物和扩增目标片段在选择目标基因或片段后，接下来需要设计引物用于扩增目标片段。

引物应该与目标序列的两端相互衔接，同时还需要保证引物的特异性，以避免扩增到非目标片段。

引物设计可以借助计算机软件进行，通常通过在目标序列两端添加适当的引物序列，然后使用聚合酶链式反应（PCR）进行扩增。

第五步：克隆目标基因或片段在扩增目标片段后，接下来需要将其进行克隆。

常用的克隆方法包括限制性内切酶克隆、TA克隆、基于CRISPR等。

高通量基因测序技术及数据分析

高通量基因测序技术及数据分析随着科学技术的不断进步，基因测序技术也取得了巨大的突破。

高通量基因测序技术（high-throughput sequencing technology）是一种快速、精确、高效的测序技术，它可以大大缩短测序时间，降低成本，从而在基因研究领域取得重大突破。

高通量基因测序技术的原理是将DNA或RNA样品分为微小的片段，并在高通量测序仪中进行并行测序。

这种技术通过同时测序多个DNA片段，极大地提高了测序效率。

高通量测序技术可以应用于各种领域，包括基因组学、转录组学、表观遗传学和蛋白质组学等。

高通量基因测序技术主要有以下几种：Illumina测序技术、Ion Torrent测序技术、PacBio测序技术和Oxford Nanopore测序技术。

其中，Illumina测序技术是最常用的高通量测序技术之一。

它基于桥式PCR和碱基按键扩增（SBG）技术，可以快速、高效地获得大量的测序数据。

高通量基因测序技术的应用广泛。

在基因组学研究中，高通量测序技术可以用于对物种的全基因组进行测序，帮助研究人员了解物种的遗传变异、进化历程和功能等。

在转录组学研究中，高通量测序技术可以实现对整个基因组的转录本进行测序，从而揭示基因的表达模式和调控网络。

在表观遗传学研究中，高通量测序技术可以用于DNA甲基化和组蛋白修饰的检测，从而深入了解表观遗传学在基因调控中的作用。

在蛋白质组学研究中，高通量测序技术可以用于蛋白质质谱的分析，帮助鉴定蛋白质的序列和修饰。

高通量基因测序技术的数据分析是测序研究的重要环节之一。

在高通量测序实验中，产生的大量数据需要进行存储、处理和分析。

数据分析的主要目标是从原始测序数据中提取有用的信息。

高通量基因测序数据分析包括数据预处理、序列比对、SNP和InDel检测、基因表达分析、功能注释等步骤。

首先，数据预处理是数据分析的第一步，用于去除测序数据中的低质量读取、接头序列和重复序列。

植物光合作用相关基因的克隆与表达

植物光合作用相关基因的克隆与表达植物光合作用是指在光的作用下，植物体内的叶绿素吸收光能，将其转化成化学能，从而产生能量和氧气的过程。

植物光合作用是生命的基础能量来源之一，也是维持生态系统平衡的重要过程。

植物光合作用的相关基因克隆和表达，是近年来植物学研究的热点之一。

这一研究方向主要集中在植物光合作用的细胞生物学、分子生物学和基因组学等方面。

细胞生物学角度，植物体内的光合细胞有两种类型：一种是负责光合作用的叶绿体细胞，另一种是负责运输产物的质体细胞。

这两种细胞在外形和功能上有所不同，其内部的基因表达和调控也存在差异。

因此，研究植物光合作用相关基因的克隆和表达，需要从细胞类型的角度进行分析。

分子生物学角度，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，主要探索基因的结构、功能和调控等方面。

例如，利用PCR技术和基因克隆技术，可以获得植物体内的光合作用相关基因，然后通过生物信息学工具对基因序列、编码蛋白质和表达谱进行分析。

另外，还可以应用转基因技术构建基因敲除或添加的重组植物株系，进一步揭示光合作用相关基因在植物体内的作用和机理。

基因组学角度，随着高通量测序技术的发展和基因组数据的丰富，研究人员可以在全局范围内分析植物光合作用相关基因的基因组学特征、进化关系和功能注释。

例如，通过对一些重要植物基因的全基因组序列比较，可以发现在多个物种中保守的部位和变异的部位，进而获得这些基因在植物演化中的起源和分化过程。

此外，研究人员也可以利用系统生物学的方法，将各个基因的作用和调控网络进行拼凑和模拟，从而模拟出更加细致的植物光合作用模型。

总之，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，对于理解植物生物学和解决环境保护和农业生产中的问题，具有重要意义。

希望未来能够有更多的研究成果和创新突破。

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在增强子陷阱中，报告基因与启动子的TATA框和转录起始位点相融合，此时的少量启动子序列不会引起报告基因的表达，但是，当附近有增强子元件时启动子被激活使报告基因表达。
启动子陷阱和基因陷阱含有无启动子的报告基因，因此只有当插入到转录单位且方向相同时，报告基因的表达才有可能发生。启动子陷阱中，报告基因插入到exon 时才表达，相反，基因陷阱中的报告基因带有剪接序列，当插入到intron中时才表达。
在拟南芥菜中发展出了一种称为激活标记系统（activation-tagging），已克隆了若干个基因。这套系统是用T-DNA载体，在其右边界整合多个CaMV35S增强子。在拟南芥菜的激活标签库中，Weigel等鉴定出了30多个各种性状的显性突变，对一组突变体的分析表明增强子插入位点附近的基因过量表达。
所以基因组序列完成之后，接下来的是大规摸功能基因的鉴定。已明确构成被子植物基因组最基本的约20，000～25，000功能基因。高通量功能基因克隆：通过插入失活的方法产生大量的突变体，特别是在拟南芥菜、水稻、玉米、矮牵牛花和金鱼草中。对插入位点的旁邻基因组序列进行克隆，通过计算机搜索可获得导致突变性状的基因序列。
植物基因组的大小差别很大，基因组大小的这种差异主要是由重复序列造成。被子植物中所必须的基因数目不会差异很大。这可从禾谷类作物的基因组分析中看出来，禾谷类不同作物的基因组差异很大，如水稻的基因组只有玉米的20％、小麦的3％，而基因组成和顺序存在着广泛的同线性。从水稻中获得的基因序列信息可以用来从其他禾谷类作物中分离相对应的基因。
在分离插入位点的侧翼序列时，首先必须确认分离后代的各种突变性状是否由T－DNA插入造成。只有当突变的性状与T-DNA的插入共分离时，再来分离侧翼序列。
6.2.2. 转座子标签
转座子标签已成为非常有用的工具来分离新的基因。第一个成功分离植物基因的是通过Ac/Ds（Activator-Dissociation）转座系统。其他的转座系统，如En/Spm （Enhancer/Suppressor-mutator）和Mu （Mutator）被用来克隆若干个玉米基因。
• 这是一种高效的用反求遗传学的方法来研究功能基因，它可以大范围筛选通过化学方法诱导的突变体，适用于拟南芥菜和其他各种植物。
上面我们介绍的基因失活是外源DNA插入后引起，所以易导致致死突变。这一方法中用化学诱变剂处理只引起点突变，产生一种传统意义上的等位基因系列，这种亚致死等位基因只引起性状的变异，不会导致死亡，所以对于研究一些必须的基因特别有用。化学诱变剂处理的另外好处是突变的频率高、不需组织培养等过程。这一方法中最关键的问题是必须能灵敏检测出点突变。
6.2.1. T-DNA标签
在拟南芥菜中，许多基因通过T-DNA 标签的突变系被分离到。在美国University of Wisconsin已建立了含60，480个拟南芥菜T-DNA标签系的群体。在水稻中也用类似的方法获得T-DNA 标签系，因为T-DNA是随机插入，又可以多代遗传，估计需要471，000个T-DNA标签系才有99％的可能性在任一基因中含有 T-DNA插入。
在水稻中通过农杆菌介导将Ac/Ds 系统导入到水稻中，在Ac存在的情况下，80％Ds可以从原来位置上切离，配子中的切离频率不超过40％，能产生大的突变体群体。
6.2.3. 反转座子标签
水稻中内源因子Tos17可以在组织培养过程中被激活，拷贝数可扩增到30个。用Tos17的基因knockout系统被发展起来。Tos17倾向于插入到基因区，插入频率比非基因区高二倍。通过这一方法已克隆到水稻homeobox基因OSH15，水稻光敏色素A等。
点突变的M2单株混合群体可以作为一种研究资源供社会共享，用于研究感兴趣的基因有无发生突变。只要将感兴趣基因的序列输入，在突变系列库中查找这一基因有无突变体的存在。如果有就可以索取对应的突变体植株。
用这一载体总共产生了13，450个T-DNA 插入系。GUS的组织化学检测表明GUS着色频率比不带增强子的载体高二倍。增强子插入位点附近的基因表达明显增加。因此用pGA2715转化的系既可用gus报告基因筛选启动子，又能产生功能获得（gain-of-function）突变。
第三节、 TILLING （Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）
6.2.3. 激活标签（activation tagging）
传统的T-DNA或转座子插入使基因失活，这些方法在研究冗余基因的功能时就不敷应用，也无法分离那些功能失活后会造成早期致死、雌雄配子败育的基因。在拟南芥菜中，少于10％的基因标签会产生可见的性状变异，因此必须用其他的方法来分离功能基因。
基因组中有很多大的基因家属，如细胞色素P450（参与多糖的生物合成），抗病相关的基因、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶等。要解决的主要问题是确认基因家属某一具体成员的确切功能。
通过同源比较的方法（BLAST Search）可以大致预测54％基因的功能，然而仅仅通过预测还远远不能确认这一基因在生物体中的具体功能。如通过序列的分析，约13％的拟南芥菜基因推测与转录和信号传导有关。然而知道某一基因编码激酶或转录因子并不能提供任何有用的信息来说明这一基因控制什么样的生理生化过程。
TILLING方法：种子用EMS处理发生诱变，当代植株（M1植株）自交，M2代单株的DNA样本用来突变筛选，同时将它们的种子分别储存。单株DNA样本混合、DNA混合池排列到96孔板上用于基因特异的PCR筛选。
PCR产物同一内切酶（CELI）混合、切割双链中不配对的碱基。切割后的产物在自动测序仪上电泳，分析条带。不同的双链末端可以标上不同的染料用来准确、快速鉴定条带。一旦当在某一DNA混合池中检测到突变后，进一步筛选组成这一DNA混合池的单个DNA样品直到确定相应的突变个体。
基因陷阱提供了很有效的方法来鉴定基因，因为这一系统是建立在报告基因表达基础上的，不需要突变的性状，因此在分离传统方法上很难分离的二类基因上很有用：1）功能冗余的基因；2）在不同发育阶段上起功能的基因（各个发育阶段上的基因发生突变的话很可能导致致死突变）。
最近，Jeong等人又开发出了新的 T-DNA载体，pGA2715，这一载体具有启动子陷阱和激活标签二种特性。这一载体在右边界含有一个无启动子的GUS报告基因。另外，有多个35S增强子位于左边界。
Identification of an R gene by inactivation with transposons
当含有Ds的转基因植株同含有Ac 的转基因植株杂交后，在后代中可以观测到高频率的突变体，包括生长、形态发育、开花期、抗性等的变化。首先要确定这些变异是否由Ds引起。Ds转座频率在后继世代大大下降。
目前从各种作物中已获得大量的EST序列，这些序列在模式植物和研究植物之间作为一种基因同形体（isomorphisms），提供一种跨基因组差异的平台，来利用模式作物广泛的序列信息。如，在与某一功能相关的基因被克隆到以后，就可以用它在其他作物中找到同根基因（orthologs）。
各种显花植物大量EST的产生以及水稻、拟南芥菜等基因组序列的完成，就有可能来研究高等植物基因组序列的相似性。大多数的基因在不同的高等生物中表现出核苷酸序列和氨基酸序列的相似性。很少有编码蛋白的被子植物基因在拟南芥菜和水稻中没有同根基因（orthologs）。高等植物发育上的差异可能主要是由于转录调控因子反式调控序列的变化。
通过突变方法分析基因功能的主要限制是 1）许多基因由多个拷贝组成，拷贝紧密连锁且功能互补，很难产生功能失活突变体； 2）对于致死突变和不育突变都无法获得稳定的突变后代，也就无法克隆基因。
基因芯片和Micrroarray：理论上，基因组上所有基因的DNA序列可以被放到一个小的固体支撑物上用来同标记的RNA进行杂交。这样，我们可以获得每个基因对病原菌、害虫、干旱、低温、盐碱、光周期、和各种环境因子变化等的反应。同样，我们可以获得大量的有关发育过程中基因的表达变化。所有这些信息在研究基因的功能、生理生化的机理等都非常有用。
第二节、高通量克隆植物功能基因－基因标签法
在若干种植物中已通过转座子插入使基因失活来研究基因的功能。用转移DNA（TDNA）作为诱变剂（mutagen）来标签基因已在拟南芥菜上发展起来。T-DNA的插入是一个随机事件，插入后可以稳定遗传。
插入突变在功能基因研究中已成为一种非常诱人的方法，因为已发展了若干种成熟的方法来分离插入A标签系群体时最大的困难是在当代获得足够数量的种子，可能是由于T-DNA插入的致死效应导致育性很低。T-DNA插入造成的功能改变常常是隐性的，突变性状可以在分离后代中观测到。
分析了1，600个标签系的T2代后， Jeon等人发现了各种突变的性状：最多的是矮秆性状（ 7.0% ）和叶色突变（9.5%），苗期死亡的占1.1%，生殖器官也有少量变异，如 depressed paleae, filamentous flowers, extra glumes, long sterile glumes 等。约 1.8% 完全不育， 0.2%提前开花、0.1%推迟开花。
第三节、基因陷阱（Gene Trap）
• 报告基因（reporter gene）的插入产生融合基因，融合基因可用来检测单个基因的表达。通过这样方法，根据基因在不同时间和不同条件下的表达谱来分离基因。因为插入 DNA的序列已经知道，这一序列可用作“标签”很容易分离到基因。
报告基因用来构建三种基本的基因陷阱载体：增强子陷阱、启动子陷阱和基因陷阱。每一种类型能应答插入位点的顺式作用调控序列。