小鼠破骨细胞分离培养及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｙ ｕ ｅ 。 Ｃ ＨＥＮ Ｓ ｕ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， ＤＩ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｌ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ， ｆ ｉ ｎ ｄ ａ ｂｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｔ ｏ ｓ ａ ｔ ｉ ｓ ｆ ｙ ｔ ｈｅ ｉ ｒ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎｄ ｑｕ ａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔ ｈｅ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｋｉ ｌ ｌ ｅ ｄ ｕ ｎ—
004破骨细胞培养及鉴定
1．主要实验材料 (1)实验动物 大鼠、兔、人等。 (2)培养液 M199培养基、RPMI 1640培 养基或MEM培养基，配制时须加20％的小牛血 清、HEPES 25mmol/L，粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子100ng／m1。 (3)淋巴细胞分离液 密度为1.077g／m1。
2．培养方法 (1)薄骨片的制备 同成熟破骨细胞 分离细胞培养法中的薄骨片制备。 (2)骨髓单核细胞分离及培养 所有 取材、分离细胞及培养过程均须在无菌 条件下进行。
／m1)的抗生素溶液的小容器中，每次10-20min。最
后可浸在盛有含抗生素的培养液的容器内，置4℃(短 期)或-20℃(较长期)冰箱内保存备用。
(2)破骨细胞的分离和培养 所有取材、 分离与培养过程须在无菌条件下进行。 ①取出生后3-5d的大鼠，拉颈处死后置 于盛有75％酒精的容器中，消毒3-5min后取 出放入培养皿中。 ②用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉，取 股骨和胫骨等长骨，放入盛缓冲液的培养皿 中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨。
③将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清 洗后，置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术 刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内 表面，同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液， 冲洗骨内表面多次，直至骨内表面变白为止。 ④用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培 养液2－5min，使附着于碎骨片上的破骨细胞分离 脱落于培养液中。静置1－2min后，待碎骨片沉降， 收集细胞悬液。
⑵单个核细胞分离：采用密度梯度离心法，向 采集的血样标本内加入等量的PBS，取6支10ml离心 管，分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml，再小心
缓缓地向各离心管内加入上述含PBS的血样各2.5ml，
然后以2000rpm,水平离心20min，取出后在絮状层
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
《小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究》范文
《小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究》篇一一、引言小鼠的生殖细胞（PGCs，Pluripotent Germ Cells）的发育过程对于哺乳动物生殖生物学具有重大意义。
在动物和人类的发育过程中，生殖细胞的形成与增殖直接影响了个体的繁殖潜能。
本研究致力于对小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养进行初步研究，旨在为生殖生物学、细胞生物学和医学领域提供新的研究视角。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括：小鼠胚胎、培养基、试剂、抗体等。
2. 方法（1）PGCs的分离：通过显微操作技术从小鼠胚胎中分离出PGCs。
（2）PGCs的鉴定：利用免疫荧光技术对分离出的PGCs进行鉴定。
（3）体外培养：将分离并鉴定的PGCs进行体外培养，观察其生长和分化情况。
三、实验结果1. PGCs的分离通过显微操作技术成功从小鼠胚胎中分离出PGCs，其形态特征明显，易于识别。
2. PGCs的鉴定利用免疫荧光技术对分离出的PGCs进行鉴定，结果显示其具有PGCs的特异性标记，证明成功分离出PGCs。
3. 体外培养研究将分离并鉴定的PGCs进行体外培养，观察其生长和分化情况。
结果显示，PGCs在体外培养环境中能够正常生长和增殖，且保持其多能性。
四、讨论本研究成功分离并鉴定了小鼠PGCs，并在体外培养环境中进行了初步研究。
结果表明，PGCs在体外培养环境中能够正常生长和增殖，这为进一步研究PGCs的发育机制、疾病模型以及生殖细胞治疗等领域提供了可能。
同时，本研究的成功也为其他哺乳动物PGCs的研究提供了借鉴。
然而，本研究仍存在一些局限性。
首先，虽然我们已经证明了PGCs在体外培养环境中的生长和增殖能力，但关于其具体分化方向和功能的研究尚待进一步深入。
其次，关于PGCs在体内外的互作机制、信号通路以及与周围微环境的关系等问题仍有待研究。
最后，由于PGCs具有高度多能性，其潜在的应用价值和风险也需要进一步评估。
五、结论本研究为小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养提供了新的方法和思路。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
小鼠成骨细胞体外分离培养及鉴定
随着细 胞培 养技术 的发展 ，采用 体 外 培养 成 骨 细胞 评 价人工 骨 替 代材 料 的生 物 活 性 、 物 相 容性 生 及骨 诱 导 性 等 ， 已成 为 重 要 的研 究 手 段 。成 骨 １ 细胞 的体 外 培 养 可 以 排 除 体 内多 种 因 素 的相 互 影
（． １石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室 ； ２ 石 河子 大学 医学 院组织胚 胎 学教 研室 ， ． 新疆 石 河子 ，３０ ２ ８ ２０ ）
【 摘要 】 的 ： 目 目 针对 前体外培养成骨细胞方法各异 ， 建立一种 简易 的原代培养成骨细胞 的方法 ， 并研究其生物学特
２０ ０ ８年 ｌ 月 ２
农
垦
医
学
Ｄｅ ２ ０８ ｃ． ０
第３ ０卷
・
第６ 期
Ｊｕ ａ ｆ ｎ ｋ ｎ Ｍｅ ｉｉｅ ｏ ｒ ｌ ｇ ｅ ｄｃｎ ｎ ｏ Ｎｏ
Ｖ０ ． ０ Ｎｏ． １３ ６
论著 ・
小 鼠成 骨 细 胞 体 外 分 离 培 养 及 鉴 定
符毓 豪 王 菊２ 周 宗瑶２
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２ ｉ， 洗 ， 干 ； 甘 油 明胶 封 片 ， 检 ； 所 染 ｍｎ 水 待 ⑤ 镜 ⑥
结 果 为红色 即 为 阳性 ， 之为 阴性 。 反
骨带骨膜 ， 经无菌 Ｐ Ｓ缓 冲液洗 涤 ２ Ｂ ３次 ， 在含 １％ ５
１４ ３ 钙 化 结节 染 色 （ 素红 法 ） 细 胞 接种 方 法 ．． 茜 同上 ， 培养 １ｄ后 ， 下 可 见 黑 色 不 透 明 区 域 ， 时 ０ 镜 此 进行 染 色 ， ７ ％ 乙醇 固定 １ｍｎ０ ２ 用 ５ ０ ｉ， ． ％茜 素 红 染 色 ３ｍｎ蒸馏 水 冲洗 ， 油 明胶 封 片 。 ０ ｉ， 甘
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
《小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究》范文
《小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，对生殖细胞的研究已成为当前生命科学领域的重要课题。
小鼠PGCs（原始生殖细胞）作为研究生殖细胞发育和分化的重要模型，其分离鉴定及体外培养的研究对于理解生殖细胞的发生和发育机制具有重要的科学意义。
本文旨在研究小鼠PGCs的分离、鉴定及其在体外培养条件下的初步发展情况。
二、材料与方法2.1 材料实验所使用的小鼠为特定品系小鼠，采集其胚胎用于PGCs 的分离。
此外，还需培养基、酶类、抗体等实验材料。
2.2 方法1. PGCs的分离：采用酶消化法从小鼠胚胎中分离PGCs。
2. 鉴定：通过免疫荧光染色法对分离得到的细胞进行鉴定，观察PGCs的形态特征及表达的相关基因。
3. 体外培养：将鉴定后的PGCs接种于培养基中，观察其生长及分化情况。
三、实验结果3.1 PGCs的分离通过酶消化法成功从小鼠胚胎中分离出PGCs，并获得较高纯度的细胞。
3.2 PGCs的鉴定免疫荧光染色结果显示，分离得到的细胞具有PGCs的形态特征，并表达相关基因，证实为PGCs。
3.3 体外培养将鉴定后的PGCs接种于培养基中，观察其生长情况。
PGCs 在体外培养条件下能够增殖并保持其特性，且在适当条件下可发生分化。
四、讨论4.1 PGCs的分离与鉴定本实验采用酶消化法成功分离出小鼠PGCs，并通过免疫荧光染色法进行鉴定。
该方法具有较高的纯度和准确性，为后续研究提供了可靠的实验材料。
4.2 PGCs的体外培养在体外培养条件下，PGCs能够增殖并保持其特性，这为研究PGCs的发育和分化机制提供了重要的实验依据。
同时，通过调整培养条件，PGCs可发生分化，为研究生殖细胞的分化过程提供了新的思路。
4.3 研究意义本研究为进一步了解小鼠PGCs的发育和分化机制提供了重要的实验依据。
同时，对于理解人类生殖细胞的发育和分化过程、探索生殖系统疾病的发生机制及治疗策略具有重要意义。
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小鼠破骨细胞分离培养及鉴定摘要选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。
采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。
结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。
提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。
从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。
与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。
该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物。
1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器。
α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。
YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。
1.2 试验方法1.2.1 成骨细胞分离培养。
将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。
无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。
用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。
将骨片剪成糊状，加入0.1%Ⅱ型胶原酶3 mL，置气浴恒温振荡器内80 r/min、37 ℃振荡消化1 h[2-3]。
将头盖骨转入1.5 mL指形管中，用剪刀剪碎，直至剪成糊状（需时30 min），混匀转入50 mL离心管，封口，37 ℃气浴摇床消化60 min，80 r/min；转入离心管用PBS洗涤然后转入15 mL 离心管，离心10 min，1 500 r/min。
弃去上清，再反复用PBS吹打洗涤离心2次，1 000 r/min，5 min。
弃去上清，沉淀即为成骨细胞（OB），加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀，再加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀静置20 s 后取上悬液接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养。
24 h后换液，以去除骨碎片和未贴壁的组织块、细胞。
之后每隔48 h换液1次，5～7 d后生长良好。
1.2.2 骨髓细胞分离。
参阅国内外文献[4-6]，分离3只3月龄大的小鼠的胫骨和股骨，取25号针头，用HBSS+10%胎牛血清将骨髓吹出。
先用19号针，再用25号针将细胞吹碎得到细胞悬液。
通过ficoll将红细胞移去（600 g，25 min，刹闸关闭），收取细胞后用HBSS清洗1遍，用1 mL培养基悬浮细胞保持细胞在冰上。
1.2.3 共培养操作。
每一板中骨髓细胞的数量和成骨细胞的最适数量是不同的。
这个最适数量要考虑小鼠的品种，例如采用的是MF1小鼠，则其破骨细胞最适的密度为：在96孔培养板中，每孔添加100 μL培养基+10 nmol/L VD3+8×103成骨细胞，为防止溶液的蒸发，边孔不添加细胞，但应填满水。
在第1天，每个孔添加50 μL 2×105个新鲜分离的骨髓细胞，培养基中应该含有10 nmol/L VD3。
在第6天，重新换50%新鲜的培养基，方法如下：①每孔添加150 μL含有20 nmol/L VD3的新鲜培养基；②让细胞沉降15 min；③然后每孔再移掉150 μL。
在第10天的时候，进行固定和染色。
重新换液需要非常谨慎，因为成骨细胞层很容易受到干扰，脱落，这会导致破骨细胞数量的减少。
通常情况下，出现第1个破骨细胞一般在第6天，适量的破骨细胞的出现一般在第7～10天。
1.2.4 TRAP染色。
取培养24 h的玻片，置于2.5%戊二醛中在4 ℃条件下固定10 min，用蒸馏水冲洗干净后，浸入孵育液中，在37 ℃条件下避光水浴1 h，然后置于光镜下进行细致观察[2-3]。
1.2.5 破骨细胞形态学观察。
倒置显微镜观察细胞的形态、生长及贴壁情况。
1.2.6 破骨细胞的骨吸收。
第二阶段培养时加入α-MEM培养，3～4 d后将象牙片取出，用PBS冲洗，置于0.25 mol/L氢氧化铵溶液中超声处理3次（5 min/次），去除附着细胞，暴露吸收陷窝。
然后用梯度乙醇脱水，多聚甲醛固定，CO2临界点干燥，离子喷镀仪喷镀镀金，扫描电镜摄片[2-3]。
2 结果与分析2.1 破骨细胞的一般生物学特性在共培养6 d后能观察到破骨细胞，细胞生长快，2 h已基本贴壁，且紧密度较高。
主要为体积较小的类圆形和不规则形，一般1～2个核，极少数有3个核，有伪足。
破骨细胞难以用胰蛋白酶-EDTA进行消化，且随着细胞代数增加，消化难度加大。
消化前用PBS清洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，轻轻吹打，将部分脱落的细胞移去，然后用PBS浸泡数分钟，用胰蛋白酶继续消化，如此反复可消化大部分细胞[2-3]。
2.2 破骨细胞的一般形态观察共培养7 d后，观察到细胞贴壁生长，体积较大，增殖旺盛，呈油煎蛋形、长条形或不规则形等，有伪足和丝状突起。
未染色前细胞边缘模糊，胞内的核很难与其中的杂质细胞进行区分[2-3]。
培养细胞中混有大量骨髓基质细胞和红细胞，破骨细胞较少（图1）。
2.3 破骨细胞的TRAP染色结果共培养8 d后，置于倒置显微镜下观察，TRAP阳性破骨细胞质中含有大量酒红色颗粒，细胞核阴性，细胞大小不一，有2～50个核，甚至更多，以10多个核的细胞居多。
核积聚在细胞中央，TRAP染色后，破骨细胞形态清晰（图2），呈油煎蛋形，或哑铃状，很容易辨别。
2.4 破骨细胞象牙片吸收陷窝观测结果扫描电镜观察结果显示，未加破骨细胞象牙片（图3）表面较光滑，无吸收陷窝生成。
加破骨细胞象牙片（图4）观察到的吸收陷窝立体感强，陷窝底部纤维纹路清晰，骨组织被侵蚀、溶解，形成明显的吸收陷窝，陷窝呈蜂窝状、圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态，边界清楚。
3 讨论破骨细胞是一种多核巨细胞，是唯一产生骨吸收的细胞类型。
Chambers et al[7]建立的破骨细胞体外培养技术为破骨细胞体外培养奠定了基础。
截至目前，已可以从多种动物四肢长骨分离成熟破骨细胞，如新生大鼠和小鼠、新生兔、鸡胚，甚至引产胎儿的长骨。
破骨细胞的鉴定方法：一是细胞的形态特点有多核、伪足运动活跃[8]；二是抗酒石酸酸性磷酸酶强阳性；三是含有降钙素受体；四是与骨片共同培养，可以形成骨吸收陷窝。
破骨细胞能分泌抗酒石酸酸性磷酸酶，TRAP染色呈阳性。
破骨细胞可在象牙片上或骨片上形成骨吸收陷窝，陷窝成圆形、椭圆形或不规则形，边界清晰[2-3]。
用小鼠共培养操作诱导获得具有特征性的破骨细胞。
运用倒置相差显微镜、TRAP染色和骨吸收陷窝来鉴定培养的破骨细胞，从结果中发现，在倒置相差显微镜下未染色前破骨细胞边缘很不清晰，破骨细胞胞内的核很难与视野中的杂质细胞如红细胞和骨髓细胞相区分。
100倍显微镜下破骨细胞数量比较少，而且混有大量骨髓基质细胞和红细胞。
用TRAP染色鉴定，能够很清晰地找到破骨细胞，破骨细胞呈油煎蛋形、长条形或不规则形等。
图片中破骨细胞有大有小，这是因为破骨细胞是通过多个核融合形成的，因此当融合的核数量多时，破骨细胞也就比较大。
在培养过程中也发现破骨细胞数量偏少，这与利用兔、鸡等动物分离的破骨细胞得出了相同结论。
在扫描电镜4 000倍下观察象牙片上的骨吸收陷窝，很容易发现破骨细胞的特征性功能——骨吸收，而且发现骨吸收陷窝有大有小，有浅有深，这与培养的破骨细胞的活性以及大小有着密切的关系[9]，当然这需要进一步的研究证明。
4 参考文献[1] 夏维波.骨重建在维持骨强度中的意义[J].中华医学杂志，2006，86（6）：363-365.[2] 刘俊栋，顾建红，刘海霞，等.鸭破骨细胞的培养及鉴定[J].中国兽医杂志，2007（11）：17-18.[3] 顾建红，刘俊栋，刘海霞，等.番鸭破骨细胞的培养及鉴定[J].中国兽医学报，2008（1）：75-78.[4] V AN’T HOF R J.Osteoclast Formation in the Mouse CocuLture Assay[J].Bone Research Protocols，2004（11）：158-165.[5] 姚静，钱存忠，张皎，等.鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定[J].南京农业大学学报，2005，28（3）：88-91.[6] 刘翠萍，李菊明，唐伟，等.小鼠骨髓内破骨细胞诱导形成的实验观察[J].中国临床康复，2005，9（2）：47-49，267.[7] CHAMBERS T J，MAGNUS C J.Calcitonin alters behaviour of isolated osteoclasts[J].The Journal of Pathology，1982，136（1）：27-39.[8] V AANANEN H K，ZHAO H，MULARI M，et al.The cell biology of osteoclast function[J].Journal of Cell Science，2000，113（3）：377-381.[9] 张炜真，于世凤，郑麟蕃.大鼠破骨细胞体外分离培养和鉴定[J].解剖学报，1995（3）：291-293，347.。