彩叶植物红叶形状RAPD标记及查尔酮合酶(CHS)基因的cDNA分离与克隆

彩叶植物红叶形状RAPD标记及查尔酮合酶（CHS）基因的cDNA分离与克隆作者：高华北孟佳欣贾艳晶李彦慧来源：《智富时代》2016年第10期【摘要】在分子评价的基础上，利用李属植物中具有红叶形状的材料，以及绿叶材料构建DNA池，利用分子手段，寻找与李树叶片红色性状的RAPD分子标记;并构建红叶×绿叶的杂交F1代，通过对F1群体各个植株的RAPD分析，计算该标记与基因的遗传距离，为李目的基因的克隆，分子遗传图谱的构建提供依据。

结合国内外研究，参照花卉及农作物上已克隆的CHS基因，利用同源克隆的方法，对李属植物中的几种材料特别是紫叶矮樱的查尔酮合酶基因进行克隆。

为实现植物体彩色化，为园林植物丰富彩叶树种。

【关键词】李属;叶色;红叶形状;RAPD色彩是观赏植物最重要的特征之一。

传统的绿化树种相对单调，景观色彩比较缺乏，已远远不能满足人们的需要。

彩叶植物，尤其是红色叶树种，以其绚丽的叶色，极大丰富了城市的景观层次，成为目前园林绿化、美化的新宠。

紫红色叶树种，其叶片呈红色主要是受遗传因素、环境因素和色素变化等方面的影响所致。

植物遗传多样性是红色叶树种叶片显红色的基础，如红叶李、红花木、紫叶矮樱等，其叶片红色受其遗传物质——基因的控制。

植物颜色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。

其中，起最主要作用的是花色素。

花色素含量的增高或降低都可能改变植物的颜色。

查尔酮合酶（chalconesynthase，CHS）是花色素合成中的一个关键酶，它催化丙二酰辅酶A的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶A的一个乙酸基的缩合，产生柚配基查尔酮。

查尔酮合酶在植物中表达量的改变可能影响植物的颜色。

近年来利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR及鉴别筛选等手段从玉米、金鱼草、矮牵牛等植物中分离和克隆了部分与花青素生物合成的结构基因与调节基因，并应用于花卉育种，这是目前花青素研究的热点。

邵莉、李艳、黄胤怡分别从矮牵牛，中国水仙上成功克隆出查尔酮合酶基因。

通过外源结构基因导入，利用反义基因法和共抑制原理等技术调控花青素等类黄酮物质合成，从而改变植物花色、果色与叶色已经取得了许多成果。

反义RNA的抑制和共抑技术，已被成功地用来抑制CHS基因的活性，在CHS基因反义链转基因的植物中，CHS的mRNA活性都有所降低，从而造成CHS无色底物的积累，使花颜色变浅或成白色。

Meyer等将玉米（ZeamaysL.）的DFR基因导入白色矮牵牛植株中，单拷贝的转基因矮牵牛的花色表现为红色，而多拷贝的转基因矮牵牛的花色表现为白色。

Lloyd等[39]将玉米调节基因C1和R导入烟草和拟南芥之后，使两个物种的白色花冠都不同程度地着色变粉。

Quattrocchio等将一系列花青素代谢的调节基因转入矮牵牛之后，得到红色的愈伤组织、粉红色花冠。

包满珠等将C1和Lc基因转入矮牵牛之后，部分转基因植株的花冠筒由白色变为粉色。

1988年荷兰自由大学在世界上首先采用此法获得了矮牵牛花色变异新品种。

他们将编码CHS的结构基因反向导入矮牵牛植株之后，使转基因植株表现出不同程式的花色变异。

Courtney Gutterson等采用此法使菊花园艺品种花色得到一定程度变异。

Elomaa等将反义CHS 导入非洲菊之后，也使非洲菊的花瓣不能正常着色。

1990年美国和荷兰的科学家发现，当植物体内导入的结构基因不止一个拷贝时，往往引起转基因植株内源基因的抑制。

Napoli等、Jorgenson及VanBlokland等的研究表明，当CHS有多拷贝导入植物体内时，植株的内源CHS 便局部或全部不能表达，从而形成白色花或图案变化十分丰富的彩瓣花。

以上研究现状与成果表明，与花青素生物合成的结构基因与调节基因，已在农作物，花卉上有了较为深入的研究，特别是利用生物学技术调控花青素等类黄酮物质合成，从而改变植物花色、果色与叶色已经取得了许多成果。

花青素代谢调控基因表达的结果使植物细胞内花色素积累，在外观上表现出色彩的变化。

调节基因的导入不但使花冠色彩发生变化，而且使幼叶及其它组织也发生色彩变化，为植物的叶色、果色甚至枝条色彩的改变提供了方法、技术可行性。

在综合运用结构基因和调节基因的基础上，选用具有器官特异性的启动子，完全可能在未来实现植物体彩色化。

因此，克隆与植物叶片或花色相关基因，并将红叶性状的基因转入绿叶植物材料中，从而在分子水平上改变树种的叶片颜色，丰富园林彩叶树种资源，提高城市绿化景观效果等具有重要的理论和现实意义。

一、材料与方法（一）材料试材为李属植物以李属（Prunus）植物中的几个红叶材料红叶李（Prunus cerasifera var. atropurea Jaiq.）的叶片为试材。

紫叶李（Prunus cerasifera‘Atropurpurea ’）紫叶矮樱（Prunus cistena‘Pissardii’ ），黑杆樱李（Prunus ;wrasifers ‘ Nigra ’ ），美人梅（Prunus mume ‘Beauty mei’），四树种生长相对一致的两年生扦插苗（砧木为毛桃）为试材。

（二）方法1.李红叶形状的RAPD标记标记目标性状基因，利用分离群体分组分析（BSA，Bulk segregant analysis）。

具体做法是：采取混合样品法，尽可能地把所有的红叶品种的DNA等量混合，作为一个基因池;把十几份的绿叶品种的DNA等量混合，作为一个基因池，对两个基因池的DNA多态性进行分析，寻找可能与该性状相关的DNA片段。

（1）DNA的提取：采样时均采取幼叶，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

基因组DNA提取采用Murray 和 Thompson的方法进行。

取0.1g左右速冻叶片于1.5ml Eppendorf管中，加液氮用特制研棒研磨至粉状，加提取缓冲液（2%CTAB，1.4m NaCl ，100mM Tris-HCl，20 mM EDTA ，2%β-ME， 1%PVP）650μl ，混匀后65℃水浴40min，中间轻晃几次;取出冰浴5 min，然后加等体积氯仿：异戊醇（24：1），混匀后12000rpm下4℃离心15 min进行抽提 ;取上清加2μl的10mg/μl的RNase，混匀后37℃水浴30min;取出加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）再抽提一次;取上清加2倍体积冰乙醇使DNA絮状沉淀生成，用枪头挑出沉淀，70%乙醇洗涤3次，凉干后溶于100μl无菌水中，4℃冰箱保存待用。

（2）DNA质量检测：DNA的质量和浓度检测在紫外分光光度计上进行。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，观察是否降解。

基因组DNA统一稀释至20ng/μl备用。

（3）PCR反应体系及反应热循环程序： PCR反应参照Martins的方法：总体积20μl，10×buffer 2μl，DNA模板20ng，引物浓度0.2μM，dNTP 200μM，TaqDNA聚合酶为1U，Mg2+ 2.0mM。

反应热循环程序：预变性94℃，5min;变性94℃，1min;退火36℃，1min;延伸72℃，2min;循环45次;后延伸72℃7min。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.查尔酮合酶（CHS）基因的克隆根据Genbank中注册金鱼草（AntirrhinummajusL.）和矮牵牛（PetuniahybridaVilm）等物种的CHS基因分析其保守序列，根据保守序列设计简并引物，以上边合成的第一链cDNA为模板，PCR扩增CHS的片段，将PCR扩增得到的目的基因片段回收后连接于pGEM-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，送测序公司测序。

参照BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit User Manual的方法，用上述的反转录产物cDNA 为模板，下游引物采用试剂盒提供的引物，下游引物根据所得到CHS序列的测序结果设计，利用3’RACE 法克隆CHS 的C-末端序列，根据前面克隆到的CHS 的cDNA 的3’-端序列设计引物，通过5’RACE 法克隆CHS 的N 端序列。

将得到的目的基因回收，连接，转化，并挑选阳性克隆测序，推测其蛋白质序列，进行同源性分析，构建该基因的蛋白质分子进化树。

设计上游引物和下游引物，对红叶李植物紫叶矮樱进行基因克隆。

逆转录反应完成后，向反应体系中加入下列成分：TaKaRa LATaqTM（5U/μl）1.0μl，10×LAPCR Buffer 10μl，4μmol/L上游引物6μl，4μmol/L下游引物6μl，灭菌双蒸水57μl。

总体积为100μl。

PCR反应参数为94℃预变性5min，随后94℃1min，62℃1min，72℃4min，32个循环后，72℃再延伸10min。

目的片段回收，参照Promega公司的回收试剂盒进行。

PCR产物纯化后，直接与pUCm-TVector连接，采用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

取200μl菌液涂布于含X-gal和IPTG的筛选培养基（含Amp）平板上，37℃培养16h后，随机挑取4个白色菌落，分别接种于加有Amp50mg/L的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

按碱裂解法少量提取质粒。

以质粒DNA为模板进行PCR鉴定，委托上海博亚生物技术有限公司测定DNA序列，进行序列分析。

二、结果与分析（一）DNA的纯度及完整性检测采用CTAB法来进行DNA的检测，CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

（二）李属植物叶片红色性状相关的RAPD标记进行RAPD标记，技术简单，检测速度快，成本低，并且RAPD分析只需少量DNA样品，不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析。

利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。

扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。

这些多态性片段会出现在红叶的基因池中。

三、讨论提取高质量的DNA是分子生物学研究的基础，李属彩叶植物与其他多年生木本植物一样，提取基因组DNA过程中常常会出现氧化褐化现象，一些褐色非可溶性物质与DNA结合在一起，使DNA沉淀难溶，严重影响DNA提取的质量。

为解决这一问题，通常采用提取缓冲液中加入PVP和β-巯基乙醇以去除材料中富含的酚类物质，或在春季取刚刚萌发的嫩叶，这些材料中多糖和酚类物质等次生物质积累较少，有利于提取高质量DNA，也可采用统一提取缓冲液，分次提取DNA。